Что такое морфологическая верификация: Морфологическая верификация опухолей| Блог UNIM

Морфологическая верификация опухолей| Блог UNIM

Основная задача морфологической диагностики — установить тканевую принадлежность опухоли (гистогенез), при этом тщательно оценивается степень атипии самой клетки и нарушение тканевых структур. В большинстве случаев диагноз устанавливается по традиционно приготовленным препаратам, изучаемым при световой микроскопии. Для морфологического исследования используются различные методы забора материала:

— Соскобы и мазки-отпечатки. Являются распространенным способом диагностики поверхностных изъязвленных опухолей.

— Пункция. Выполняется при поверхностно расположенных узловых образованиях. При малых размерах подозрительных в отношении опухолевого роста образований возможно выполнение пункции под контролем УЗИ.  В неясных случаях прибегают к проведению иммуногистохимических, электронно-микроскопических исследований, иногда выявляющих дополнительные морфологические признаки, позволяющие сопоставить опухоль с исходной тканью.В настоящее время при обнаружении опухоли внутренних органов возможно осуществить морфологическое исследование практически в любой части тела.

— Биопсия с забором участка ткани (браш-биопсия). Если пункцию выполнить невозможно, используют эндоскопические методы исследования: фаринго- и ларингоскопию, эзофагогастродуоденоскопию, торакоскопию, бронхоскопию, колоноскопию и др., в ходе которых под визуальным контролем обычно забирают участок ткани (биоптат или браш-биоптат — соскоб специальной щеточкой, смывы с поверхности образования и т.д.) для морфологического исследования.

— Открытая биопсия. Открытая биопсия опухоли выполняется, как правило, после неудачных попыток верифицировать диагноз вышеуказанными методами или из-за необходимости получить больше ткани для выполнения некоторых специфических исследований, например для определения рецепторов гормонов при опухолях молочной железы, иммуногистохимического исследования при гематосаркомах. Биопсия инцизионная предполагает получение участка ткани непосредственно из патологического очага, выполняется под местной анестезией (из опухоли молочной железы, мягких тканей) или под наркозом (из костных опухолей). Биопсия эксцизионная выполняется как хирургическое вмешательство с удалением опухоли в пределах здоровых тканей. Трепанобиопсия в основном используется для исследования новообразований молочной железы, костей, мягкотканных опухолей. При невозможности верифицировать злокачественность опухоли на диагностическом этапе планируют срочное гистологическое исследование во время операции.Эти способы обычно дают достаточно материала для морфологической верификации диагноза. Наиболее информативный материал получают из участков опухоли на границе со здоровой тканью.

— Трепан-биопсия. Гистологическая верификация может быть получена при использовании специальной иглы или трепана, при этом изымается столбик измененной ткани, пригодный для гистологического исследования. Особенно важным в плане адекватной диагностики распространенности опухолей бывает исследование сомнительных по клиническим данным образований в зонах регионарного метастазирования. В большинстве же случаев сопоставление клинических проявлений опухоли с ее симптомами вне основного очага не требует верификации всех обнаруженных метастазов. Производят морфологическое исследование наиболее доступных вторичных опухолей, что само по себе делает ясным представление об истинной распространенности заболевания. Верификация диагноза осуществляется путем чрезкожной пункции метастаза или забора материала при лапаро- или торакоскопии.

Что такое морфологическое подтверждение| Блог UNIM

В этом материале мы постараемся популярным языком, доступным не только онкологу или патологу, рассказать о верификации (подтверждении) онкологического диагноза с помощью гистологического и иммуногистохимического исследования.

Сначала разберемся с терминологией. Морфологическим исследованием в медицине называют исследование структуры тканей, выполненное различными способами.

Морфологическое исследование для подтверждения онкологического диагноза — это обязательный компонент в диагностике рака. Постановлением Всемирной организации здравоохранения любой онкологический диагноз должен быть подтвержден морфологическим исследованием, так как это единственный 100% способ определить злокачественность или доброкачественность новообразования и определить подвид новообразования. В связи с этим онколог после первичной диагностики и оценки клинической картины должен направить пациента на биопсию для дальнейшего проведения гистологического и иммуногистохимического исследования. Однако существуют случаи (при определенной нозологии и локализации опухоли), когда забор биопсийного материала может ухудшить общую картину. В таких случаях забор материала осуществляется непосредственно во время операции по удалению новообразования.

Теперь перейдем непосредственно к видам морфологических исследований — гистологическим и иммуногистохимическим исследованиям материала при постановке онкологического диагноза. Эти исследования в современной медицине представляют из себя высокоавтоматизированные и высокотехнологичные медицинские услуги. Если говорить простым языком о механизме проведения исследования, то оно состоит из нескольких этапов:

· Первичная визуальная оценка врачом-патологом биопсийного материала, вырезка отдельных участков для проведения исследования

· Проводка материала (процесс специальной подготовки биопсийного материала, в результате которого получается гистологический (парафиновый) блок)

· Микротомирование (процесс обработки блока на микротоме и нарезки из него пластин биопсийного материала толщиной около 1 микрона)

· Окраска гистологических препаратов в процессоре (иммуногистостейнере)

· Микроскопия (изучение гистологических препаратов под электронным микроскопом)

Важно отметить, что врач-патоморфолог должен обладать энциклопедическими знаниями и большим опытом, основанном на объеме проведенных исследований и изучении опыта коллег.

Большую часть выше описанных процессов можно и нужно автоматизировать. Современная патоморфологическая лаборатория должна напоминать высокотехнологичное производство. Такой подход позволяет добиться не только высокой производительности работы лаборатории, но и повышения качества каждой технологической операции, а также страховки от человеческих ошибок.

Гистологическое исследование позволяет определить злокачественность или доброкачественность новообразования. Иммуногистохимическое исследование позволяет дифференцировать подвид опухоли и назначить правильное лечение. Успех химиотерапии, к примеру, напрямую зависит от качества проведения гистологических исследований.

К сожалению, общая ситуация с гистологическими (иммуногистохимическими) исследованиями в России не слишком хорошая. В большинстве лабораторий не хватает высокотехнологичного оборудования, реактивов, но, самое главное, — опытных врачей. Так, процент корректировки диагнозов по материалам, поступившим на консультацию в лабораторию патоморфологии ФНКЦ ДГОИ им. Рогачева Минздрава России составляет от 10 до 60%. Это означает, что в среднем в трети случаев неправильно верифицируется тип рака.

Отдельно нужно сказать о пересмотре готовых гистологических препаратов(стекол). Эта практика является достаточно распространённой, но, к сожалению, не дающей гарантий консультацией. Дело в том, что врач-патоморфолог, оценивая готовое стекло, не может повлиять на процедуру приготовления этого стекла(достаточно сложную и высокотехнологичную, как было написано выше). Поэтому единственным способом гарантированной консультации гистологических препаратов на сегодняшний день является проведение повторного исследования на основе гистологических(парафиновых) блоков.

Резюмируя вышесказанное, можно отметить, что морфологическая верификация является важнейшим методом подтверждения онкологического диагноза и основой для назначения лечения. Без проведения гистологических(иммуногистохимических) исследований невозможно со 100% уверенностью ставить диагноз в подавляющем большинстве случаев. К сожалению, лабораторий, имеющих возможность проводить точную и срочную гистологическую диагностику, очень и очень мало. Сроки проведения иммуногистохимических исследований в среднем в России составляют 15-20 дней, что непозволительно долго. Для сравнения, автоматизированная лаборатория Unim проводит ИГХ-исследования в среднем за 3-4 дня.

Стоимость и срок исследования

* Организация и оплата доставки сырого материала (не в блоках) осуществляется клиентом.

По всем возникшим вопросам Вы можете проконсультироваться у нашего медицинского администратора по телефону: 8-800-555-92-67 или написать нам в WhatsApp: +7 925 740 05 87

Оценка показателя морфологической верификации диагноза злокачественного новообразования по данным Государственного ракового регистра и формам государственной статистической отчетности

Уточнение морфологического строения опухолевого очага необходимо для определения адекватного плана лечения и прогноза развития заболевания [1, 2].

Показатель морфологической верификации диагноза является одним из важнейших при оценке качества оказания онкологической помощи населению [3, 4].

Показатель рассчитывается как отношение числа злокачественных новообразований (ЗНО) с морфологически (гистологически и/или цитологически) подтвержденным диагнозом к общему числу ЗНО, выявленных за конечный промежуток времени. С 2011 г. этот показатель рассчитывается за отчетный год без учета ЗНО, выявленных посмертно [5].

Для анализа показателя морфологической верификации диагноза используют информацию из объединенной базы данных (БД) Государственного популяционного ракового регистра и форм федерального статистического наблюдения — формы № 7 «Сведения о заболеваниях злокачественными новообразованиями» и формы № 35 «Сведения о больных со злокачественными новообразованиями» за 2012—2013 гг.

В целом по России, по данным государственной отчетности (форма № 35), за десятилетие показатель морфологического подтверждения диагноза статистически достоверно вырос на 10,9% и составил в 2013 г. 87,7%. Динамика показателя представлена на рисунке [6].

Динамика показателя морфологического подтверждения диагноза, 2003—2013 гг., Россия, %.

На 1 сентября 2014 г. в объединенной Б.Д. Государственного ракового регистра (ГРР) находятся сведения о 3 831 469 случаях ЗНО из 38 территориальных раковых регистров, за 2011—2013 гг. было выявлено 736 294 случая. Из разработки исключена БД ракового регистра Забайкальского края, так как ведение регистра в его современном виде там только началось [8].

В табл. 1 в динамике представлена доля использования различных методов для подтверждения диагноза солидных ЗНО по данным ГРР. Суммарно доля морфологического подтверждения диагноза возрастала и составила в 2013 г. 83,1%.

Таблица 1. Доля различных методов подтверждения диагноза ЗНО (по данным БД ГРР, 2011—2013 гг., %)

В табл. 2 представлены показатели морфологического подтверждения диагноза ЗНО, рассчитанные по данным федерального статистического наблюдения и объединенной БД ГРР. Регистры Вологодской и Оренбургской областей не представили БД за 2013 г. Из табл. 2 видно, что в целом значительных расхождений в полученных показателях нет. Показатели, рассчитанные по БД 8 территорий, несколько ниже таковых, рассчитанных по формам статистической отчетности (форма № 35), в остальных территориях показатели, рассчитанные в регистре несколько превышают показатели, рассчитанные по форме № 35, так как БД ГРР постоянно дополняются, и в компьютерную программу была внесена информация о морфологической верификации диагноза уже после формирования ежегодных отчетных форм.

Таблица 2. Динамика показателя морфологического подтверждения диагноза ЗНО (по данным государственной отчетности и БД ГРР, 2011—2013 гг., %)

Для проведения более детального анализа показателя морфологического подтверждения диагноза и стадийности из БД ГРР выбрано 673 974 случая солидных ЗНО, впервые выявленных в 2011—2013 гг. (табл. 3).

Таблица 3. Морфологическое подтверждение диагноза солидных ЗНО по стадиям, 2013 г., % (по данным ГРР)

При расчете этого показателя по стадиям опухолевого процесса выявилось, что наиболее высокие показатели подтверждения диагноза наблюдаются при I стадии. Тенденция к увеличению процента морфологической верификации диагноза в динамике наблюдается как по каждой стадии отдельно, так и в целом.

Показатели подтверждения морфологического диагноза, определенного как «800 Новообразования, БДУ» (МКБ-О, 2-е издание), среди всех морфологически подтвержденных солидных ЗНО, выявленных при жизни пациента в течение 2011—2013 гг. и распределенные по стадиям опухолевого процесса, приведены в табл. 4. При анализе этого показателя выявлен сравнительно высокий процент при III стадии заболевания, когда в основном возможно применение хирургических методов лечения и тем самым обеспечение качественного гистологического исследования материала.

Таблица 4. Доля морфологического диагноза, определенного как «800 Новообразования, БДУ» (МКБ-О, 2-е издание) среди всех морфологически подтвержденных солидных ЗНО, выявленных в 2011—2013 гг. при жизни пациента, по стадиям, %

В табл. 5 показано значение показателя морфологической верификации диагноза по некоторым локализациям в зависимости от стадии опухолевого процесса по данным регистра за 2013 г. Показатель подтверждения диагноза ЗНО, выявленных в I—III стадии, достаточно высок, в IV стадии для всех приведенных в табл. 5 локализаций этот показатель значительно ниже.

Таблица 5. Распределение показателя морфологического подтверждения диагноза некоторых ЗНО по стадиям, 2013 г., %

Уровень показателя морфологического подтверждения диагноза можно использовать и для оценки состояния диагностики, лечения, учета в целом и ведения ракового регистра в частности. Повышение качества двух последних позиций полностью зависит от строгого выполнения существующих инструкций по ведению учета онкологических больных и не требует существенных материальных затрат.

Нами было выявлено, что заполнение пункта «морфологическое подтверждение» у cr in situ не составляет 100%, а это свидетельствует о недостаточно высоком качестве ведения регистра. По-видимому, операторы, осуществляющие ввод данных о ЗНО, не вносят информацию в таких случаях, так как это не отражается в формах государственной отчетности.

Таким образом, популяционный раковый регистр, реализованный в настоящее время как ИАС «Канцер-регистр», позволяет получать различную информацию и проводить анализ состояния онкологической помощи населению в более широком аспекте. Использование ракового регистра дает возможность мониторировать качество ведения учета онкологических больных на популяционном и учрежденческом уровне, налаживать оптимальные пути взаимодействия между онкологическими учреждениями и патологоанатомической службой регионов, тем самым повышая качество оказания специализированной помощи населению.

Конфликт интересов отсутствует.

Морфологическая диагностика заболеваний рака — онкологический центр СМ-Клиники в СПб

Морфологические исследования позволяют диагностировать все виды злокачественных и доброкачественных опухолей различной локализации.

Морфологическая диагностика в онкологии

Морфологический анализ – изучение тканей новообразований на клеточном уровне. С его помощью подтверждают либо опровергают онкодиагноз, дифференцируют доброкачественные и злокачественные опухоли, определяют их характеристики. Никакие другие методы диагностики – УЗИ, МРТ, онкомаркеры – не дают точных и окончательных данных. Пока нет результатов морфологического анализа, рак только предполагается.

Заключение врача-патоморфолога – основа выбора лечебной стратегии и тактики. Для каждого морфологического типа опухоли разработаны протоколы лечения с доказанной эффективностью. Врач-онколог использует результаты морфологического анализа и протоколы при разработке индивидуальной терапевтической схемы.

Забор биоматериала: пункция и биопсия

Ткани для анализа получают во время пункции с помощью шприца, методом биопсии либо после их хирургической резекции. В ходе пункции можно взять образцы слюны, мочи, мокроты, жидкости из плевральной и брюшной полостей, смывы и мазки из дыхательных и половых путей, отпечатки/соскобы эрозий и язв.

Биопсия представляет собой иссечение участка опухолевой ткани – биоптата. Выполняетсямикрохирургическимиинструментами под визуальнымконтролем УЗ, КТ или другого аппарата.

Биопсия бывает наружной и внутренней (эндоскопической – через зонд, оснащенный микровидеокамерой). В ряде случаев – когда она может спровоцировать распространение опухолевых клеток по организму – новообразование сначала радикально иссекают, а потом отправляют на морфологический анализ для определения дальнейшей лечебной тактики.

Виды морфологических исследований в онкологии

Морфологическая диагностика представляет собой изучение тканей опухоли под микроскопом.
Цитологическое исследование
Оценка структурных характеристик клеток образца. Позволяет отличать злокачественные и доброкачественные опухоли, а также не опухолевые образования.

Основано на сравнении микроскопических особенностей строения клеток в норме и при патпроцессах. В отличие от гистологического анализа изучаются не срезы тканей, а клетки.

Гистологическое исследование

Позволяет определить вид опухоли и установить ее инвазивность. Для этого образцы проходят предварительную обработку. Обезвоженные ткани равномерно пропитывают парафином. Полученные блоки нарезают тончайшими пластинами, размещают их на предметных стеклах,высушивают и окрашивают. Подготовленный таким образом материал изучают под микроскопом.

По результатам анализа делают вывод о степени атипичности опухоли (предрак или рак) и ее агрессивности с точки зрения ангиогенеза (количества кровеносных сосудов). Исследование позволяет судить об инвазивности – взаимодействии опухоли с близлежащими тканями.

Иммуногистохимическое исследование

В ряде клинических случаев для определения эффективной лечебной тактики необходимо знать специфические белки опухоли. Их определяют с помощью иммуногистохимического анализа на основе специфической реакции антиген-антитело.

Исследование позволяет определять,какая ткань стала источникомзлокачественногоперерождения клеток, по метастазам выявлять первичный опухолевый очаг, прогнозировать варианты развития опухоли и ее резистентность к разным видам терапии. 

Особенности морфологической диагностики в «СМ-Клиника»

Забор биоматериала для морфологического исследования производится с помощью биопсии. После забора тканей, они направляются в лабораторию, где происходит их изучение под микроскопом. Если такое изучение тканей недостаточно информативно, то проводятся дополнительные исследования.

Взятие образцов тканей проводится опытными специалистами в стерильных условиях как в условиях процедурного кабинета, так и стационара. В ходе процедуры пациенту вводится местная анестезия, поэтому процедура проходит в максимально комфортных условиях. Способ забора материала зависит от локализации новообразования.

Лаборатория медицинского центра «СМ-Клиника» располагает специальным оборудованием для обработки и хранения материала, чтобы его можно было использовать повторно для уточнения диагноза. Изучение образца производится на  мощных световых и электронных микроскопах, что позволяет добиться высокой эффективности исследования.

Показания к морфологической диагностике

Данный вид исследования назначается при:

• первичной диагностике опухоли с целью определения её состава и структуры;
• подтверждении диагноза и определения стадии заболевания;
• определении этиологии метастаз и вторичных новообразований;
• контроле за ходом терапии;
• составлении программы дальнейшего лечения.

Интерпретация результатов

В результатах морфологического исследования указывают:

• макроскопическое описание – информацию о размере, цвете, форме и внешних особенностях опухоли, ее виде на срезе;
• микроскопическое описание – данные о наличии либо отсутствии злокачественных клеток, степени их злокачественности, скорости деления и распространения, вовлечении в онкопроцесс лимфатических узлов;
• подвид опухоли – гиперплазия, дисплазия, атипия, лейкоз, лимфома, саркома, карцинома;
• состояние краев резекции новообразования при анализе постоперационного материала (наличие злокачественных клеток по краю говорит о неполном удалении пат очага).

Морфологическое исследование опухоли делают 10 дней. В нашем центре в Санкт-Петербурге результат проходит двойную верификацию – подтверждение двумя врачами-патоморфологами. Это позволяет свести к нулю вероятность ошибочного результата. Предметные стекла и блоки сохраняем – вы можете запросить их для анализа в сторонней лаборатории.

Рак молочной железы

Рак молочной железы является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью у женщин. Мужчины болею раком молочной железы в 100 раз реже. Последние 5 лет отмечается рост заболеваемости раком молочной в развитых странах.


Выделяют следующие факторы риска рака молочной железы:

1. Наследственность.




2. Раннее наступление менструаций.




3. Поздний климакс.




4. Поздние первые роды.




5. Малое количество родов.




6. Сокращение сроков кормления грудью или отказ от него.




7. Доброкачественные опухоли молочной железы (фиброаденома).




8. Рак молочной железы в анамнезе.




9. Злоупотребление алкоголем.




10. Применение пероральных контрацептивов с высоким со¬держанием эстрогенов.

Знание вышеуказанных факторов помогает сформировать группу риска с включением в программу диспансеризации этих пациентов обязательного осмотра онкологом и маммографического обследования (по показаниям).

Диагностика рака молочной железы.


Большая роль в диагностике рака молочной железы отводится самообследованию женщин.


Основной метод диагностики — физикальный. Заключается в определении объемных образований в ткани молочной железы методом пальпации. Также существует ряд симптомов, характерных для рака молочной железы. Это симптом втяжения соска, симптом «лимонной корочки» и др. Обязательным при осмотре является определение состояния регионарных подмышечных лимфоузлов.


Из инструментальных методов диагностики наиболее распространена маммография. Наряду с ней применяется ультразвуковое исследование молочной железы.

     



       

 Важным этапом диагностики является морфологическая верификация диагноза путем пункционной биопсии под мануальным, рентгенологическим или УЗИ-контролем, трепанобиопсии или секторальной резекции молочной железы со срочным гистологическим исследованием. Обязательным является обследование пациента на предмет отдаленных метастазов в легкие, кости, печень.

Лечение рака молочной железы


В госпитале придерживаются следующей тактики в лечении рака молочной железы:


При I и IIA стадии применяется хирургическое лечение. 

Наиболее распространенным методом операции при раке молочной железы является радикальная мастэктомия по Мадену, заключающаяся в удалении всей молочной железы с фасцией большой грудной мышцы, клетчаткой и лимфоузлами подмышечного, подключичного и подлопаточного пространства. У молодых женщин с раком молочной железы I стадии и локализацией опухоли в верхне-наружном квадранте может быть применена радикальная секторальная резекция (квадрантэктомия) молочной железы. Учитывая тот факт, что рак молочной железы часто бывает мультицентрическим, необходимо дополнять радикальную секторальную резекцию молочной железы лучевой терапией по радикальной программе.


Если при послеоперационном гистологическом исследовании выявляются метастазы в лимфоузлы, проводится комби¬нированное лечение с применением полихимиотерапии.


За последние 3 года в госпитале пролечено 4 больных с раком молочной железы, произведено 3 радикальных мастэктомий и 1 радикальная резекция молочной железы. 

Роль морфологической верификации при определении объема операции. Клинический случай нетипичной гемангиомы околоносовых пазух | Светицкий

1. Мустафаев Д. М., Свистушкин В. М., Афзайеш Д. Наш опыт лечения больных доброкачественными опухолями полости носа и околоносовых пазух в ЛОР клинике МОНИКИ. Российская ринология 2010;18(3):52. [Mustafaev D. M., Svistushkin V. M., Afzayesh D. Our experience in the treatment of benign tumors of the nasal cavity and paranasal sinuses in the Otorhinolaryngology Clinic of the Moscow Regional Research and Clinical Institute. Rossiyskaya rinologiya = Russian Rhinology 2010;18(3):52. (In Russ.)].

2. Яйцев С. В., Федорова Н. В., Аладин А. С., Васильев Ю. С., Сычев В. И. Злокачественные опухоли полости носа и околоносовых пазух (диагностика и лечение). Креативная хирургия и онкология 2010;3: 43–4. [Yaitsev S. V., Fedorova N. V., Aladin A. S., Vasilyev Yu. S., Sychev V. I. Malignant tumors of the nasal cavity and paranasal sinuses (diagnosis and treatment). Kreativnaya khirurgiya i onkologiya = Creative Surgery and Oncology 2010;3:43–4. (In Russ.)].

3. Пачес А. И. Опухоли полости носа и придаточных пазух. В кн.: Опухоли головы и шеи. М.: Медицина, 2000. С. 297, 300. [Paches A. I. Tumors of the nasal cavity and paranasal sinuses. In: Head and neck tumors. Moscow: Meditsina, 2000. P. 297, 300. (In Russ.)].

4. Светицкий П. В. Ангиофиброма верхней челюсти. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований 2016;2–3:420–3. [Svetitskiy P. V. Angiofibroma of the maxilla. Mezhdunarodnyy zhurnal prikladnykh i fundamentalnykh issledovaniy = International Journal of Applied and Fundamental Research 2016;2–3:420–3. (In Russ.)].

5. Кормилкина А. А. Трудности диагностики злокачественных опухолей верхнечелюстной пазухи. Бюллетень медицинских интернет-конференций 2014;4(11):1216. [Kormilkina A. A. Difficulties in the diagnosis of malignant tumors of the maxillary sinus. Bulleten meditsinskikh internet-konferentsiy = Bulletin of Medical Internet Conferences 2014;4(11):1216. (In Russ.)].

6. Светицкий П. В., Аединова И. В., Волкова В. Л. Местно-распространенный рак верхней челюсти. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

Трудности морфологической верификации забрюшинных опухолей | Козлов

1. Al-Nafussi A, Wong NA. Intra-abdominal spindle cell lesions: a review and practical aids to diagnosis/Histopathology. – 2001; 38(5):387–402.

2. Anderson CE, Salter DM. Schwannoma with focal smooth muscle differentiation: a potential pitfall in the interpretation of core biopsies / Histopathology. – 2005; 46(5):592–4.

3. Ando SM, Moreno RA, Viana PCC, Yamauchi FI. Extensive renal sinus lipomatosis in xanthogranulomatous pyelonephritis simulating liposarcoma / Int Braz J Urol. – 2018; 44(3):642–644.

4. Asch-Kendrick RJ, Shetty S, Goldblum JR, Sharma R, Epstein JI, Argani P, Cimino-Mathews A. A subset of fat-predominant angiomyolipomas label for MDM2: a potential diagnostic pitfall / Hum Pathol. – 2016; 57:7–12.

5. Cardoso P, Rosa J, Esteves J, Oliveira V, Rodrigues-Pinto R. Fine needle aspiration for the diagnosis and treatment of musculoskleletal tumours / Acta Orthop Traumatol Turc. – 2017; 51(4):278–283.

6. Chang CY, Huang AJ, Bredella MA, Torriani M, Halpern EF, Rosenthal DI, Springfield DS. Percutaneous CT-guided needle biopsies of musculoskeletal tumors: a 5-year analysis of non-diagnostic biopsies / Skeletal Radiol. – 2015; 44(12):1795–803.

7. Chehab M, Zintsmaster S, Jafri SZ, Richards M, Roy A. CT-guided Transosseous Soft Tissue Biopsy: Techniques, Outcomes and Complications in 50 Cases / Cardiovasc Intervent Radiol. – 2017; 40(9):1461–1468.

8. Chen L, Kuriakose P, Hawley RC, Janakiraman N, Maeda K. Hematologic malignancies with primary retroperitoneal presentation: clinicopathologic study of 32 cases / Arch Pathol Lab Med. – 2005; 129(5):655–60.

9. El Demellawy D1, Denardi F, Alowami S. Cellular variant of extraskeletal myxoid chondrosarcoma with Ewing’s sarcoma-like areas: a diagnostic pitfall in core needle biopsy / Pol J Pathol. 2010; 61(1):37–41.

10. Delivanis DA, Erickson D, Atwell TD, Natt N, Maraka S, Schmit GD, Eiken PW, Nathan MA, Young WF Jr, Bancos I. Procedural and clinical outcomes of percutaneous adrenal biopsy in a high-risk population for adrenal malignancy / Clin Endocrinol (Oxf). – 2016;85(5):710-716.

11. Domanski HA. Fine-needle aspiration cytology of soft tissue lesions: diagnostic challenges / Diagn Cytopathol. – 2007; 35(12):768–73.

12. Duregon E, Volante M, Bollito E, Goia M, Buttigliero C, Zaggia B, Berruti A, Scagliotti GV, Papotti M. Pitfalls in the diagnosis of adrenocortical tumors: a lesson from 300 consultation cases / Hum Pathol. – 2015; 46(12):1799–807.

13. Fisher C, Montgomery EA (Eds). Biopsy interpretation of soft tissue tumors.-1st ed. / Philadelphia. LWW. – 2011. – 562.

14. Gong Y, DeFrias DV, Nayar R. Pitfalls in fine needle aspiration cytology of extraadrenal paraganglioma. A report of 2 cases / Acta Cytol. – 2003; 47(6):1082–6.

15. Gubbay AD, Moschilla G, Gray BN, Thompson I. Retroperitoneal schwannoma: a case series and review / Aust N Z J Surg. – 1995; 65(3):197–200.

16. Hruban RH, Bhagavan BS, Epstein JI. Massive retroperitoneal angiomyolipoma. A lesion that may be confused with welldifferentiated liposarcoma / Am J Clin Pathol. – 1989; 92(6):805–8.

17. Johl A, Lengfelder E, Hiddemann W, Klapper W; German Low-grade Lymphoma Study Group. Core needle biopsies and surgical excision biopsies in the diagnosis of lymphoma-experience at the Lymph Node Registry Kiel / Ann Hematol. – 2016; 95(8):1281–6.

18. Kishi Y, Kajiwara S, Seta S, Kawauchi N, Suzuki T, Sasaki K. Retroperitoneal schwannoma misdiagnosed as a psoas abscess: report of a case / Surg Today. – 2002; 32(9):849–52.

19. Murali R, Field AS, McKenzie PR, McLeod DJ, Stretch JR, Thompson JF, Scolyer RA. Melanotic schwannoma mimicking metastatic pigmented melanoma: a pitfall in cytological diagnosis / Pathology. – 2010; 42(3):287–9.

20. Ntanasis-Stathopoulos I, Tsilimigras DI, Klapsinou E, Daskalopoulou D, Vaida S, Arnogiannaki N, Salla C. Challenging differential diagnosis of an extra-adrenal paraganglioma; the role of fine needle aspiration cytology / Diagn Cytopathol. – 2017; 45(6): 565–568.

21. Petranovic M, Gilman MD, Muniappan A, Hasserjian RP, Digumarthy SR, Muse VV, Sharma A, Shepard JA, Wu CC. Diagnostic Yield of CT-Guided Percutaneous Transthoracic Needle Biopsy for Diagnosis of Anterior Mediastinal Masses / AJR Am J Roentgenol. – 2015; 205(4):774–9.

22. Riemann B, Menzel J, Schiemann U, Domschke W, Konturek JW. Ultrasound-guided biopsies of abdominal organs with an automatic biopsy system. A retrospective analysis of the quality of biopsies and of hemorrhagic complications / Scand J Gastroenterol. – 2000; 35(1):102–7.

23. Samaratunga H, Delahunt B. Mesenchymal tumors of adult kidney / Semin Diagn Pathol. – 2015; 32(2):160–71.

24. Schaefer IM, Fletcher CD.Diagnostically Challenging Spindle Cell Neoplasms of the Retroperitoneum / Surg Pathol Clin. – 2015; 8(3):353–74.

25. Seng C, Png W, Tan MH. Accuracy of core needle biopsy for musculoskeletal tumours / J Orthop Surg (Hong Kong). – 2013; 21(1):92–5.

26. Skrzynski MC, Biermann JS, Montag A, Simon MA. Diagnostic accuracy and charge-savings of outpatient core needle biopsy compared with open biopsy of musculoskeletal tumors / J Bone Joint Surg Am. – 1996; 78(5):644–9.

27. Weiss SW, Goldblum JR (Eds). Enzinger and Weiss’s Soft Tissue Tumors/Mosby Elsevier, 2008. – 1258.

Числовая и морфологическая проверка пояснично-крестцового сегмента …: Позвоночник

Дизайн исследования.

Анализ данных изображений.

Цель.

Изучить одновременные числовые и морфологические вариации пресакральных позвонков и предложить модифицированное обозначение пояснично-крестцового переходного позвонка (LSTV).

Сводка исходных данных.

Во время оценки пояснично-крестцового позвонка отклонения от типичной анатомии (числовые, морфологические или и то, и другое) могут сбить с толку практикующего врача, потенциально приводя к значительным клиническим ошибкам.Обычная практика, которая включает подсчет головного отдела от предполагаемого пятого поясничного позвонка, может привести к неточной локализации пояснично-крестцового отдела.

Методы.

Исследуемая группа состояла из 8280 последовательных пациентов, которым выполняли как магнитно-резонансную томографию поясничного отдела позвоночника с шейно-грудным сканированием, так и рентгенографические исследования поясничного отдела позвоночника. Число пресакральных позвонков было проверено каудальным отсчетом от C2 с перекрестной привязкой изображений шейно-грудного и поясничного сагиттального сканирования на рабочей станции системы архивации изображений и связи.После сопоставления нумерации на магнитно-резонансных изображениях с нумерацией на рентгенограммах пояснично-крестцовый переход был классифицирован по методу Кастельви.

Результаты.

Из 8280 последовательных пациентов 214 (2,6%) имели 4 поясничных позвонка (L4), 7384 (89,2%) имели 5 поясничных позвонков (L5) и 682 (8,2%) имели 6 поясничных позвонков (L6). В целом 877 (10,6%) пациентов имели LSTV типов II, III или IV, в том числе 439 (5,3%) с сакрализованным позвонком L5 и 438 (5.3%) с поясничным позвонком S1. Наиболее частым LSTV был позвонок L5-типа с односторонним переходом типа II, обозначенный как L5IIa, у 222 (2,7%) пациентов. Вторым по распространенности LSTV был позвонок типа L6 с двусторонним переходом типа III у 174 (2,1%) пациентов, который был обозначен как L6IIIb. Только 6945 (83,9%) населения относились к модальному типу с 5 поясничными позвонками без переходных позвонков. Все 214 (2,6%) пациентов с типом L4 и 244 (2,9%) из 682 пациентов с типом L6 не имели переходного позвонка и выглядели как пациенты с модальным типом L5.

Заключение.

Врачам-ортопедам и радиологам следует учитывать возможность как числовых, так и морфологических вариаций при оценке изображений пояснично-крестцового отдела позвоночника.

Вычислительный метод количественной оценки морфологической изменчивости склерактиниевых кораллов

Молекулярное секвенирование и морфологическая идентификация выявляют аналогичные закономерности в местных сообществах пчел на государственных и частных пастбищах восточной части Северной Дакоты

Abstract

Пчелы играют ключевую роль в функционировании измененных человеком и естественных экосистем, опыляя сельскохозяйственные культуры и сообщества дикорастущих растений. Глобальные усилия по сохранению опылителей требуют крупномасштабного и долгосрочного мониторинга для выявления изменений в демографических моделях видов и сдвигов в структуре пчелиных сообществ.Цель этого проекта состояла в том, чтобы протестировать конвейер молекулярного секвенирования, который будет использовать обычно используемый локус, производить точные и точные идентификации, совместимые с морфологической идентификацией, и генерировать данные, которые являются как качественными, так и количественными. Мы применили этот процесс секвенирования ампликонов к местным пчелиным сообществам, отобранным на землях Программы сохранения заповедников (CRP) и местных пастбищах в восточной части Северной Дакоты. Мы обнаружили, что локус 28S LSU более способен различать виды, чем локус рРНК 18S SSU, и в некоторых случаях даже разрешал экземпляры криптических видов или морфологически неоднозначных комплексов видов.В целом, мы обнаружили, что метод секвенирования ампликонов качественно точно отражает богатство отобранного пчелиного сообщества и видовую принадлежность, особенно когда доступна тщательно подобранная база данных известных последовательностей 28S LSU. Как морфологическая идентификация, так и молекулярное секвенирование выявили аналогичные закономерности в структуре местных пчелиных сообществ на землях CRP и в естественных прериях. Кроме того, подход на основе генетического алгоритма для расчета поправочных коэффициентов для таксона с использованием небольшого подмножества наиболее согласованных образцов показал, что высокий уровень количественной точности может быть возможен, если образцы свежие и обработаны вскоре после сбора.Здесь мы делаем первый шаг к молекулярному конвейеру для выявления сообществ насекомых-опылителей. Этот инструмент должен оказаться полезным для будущих национальных усилий по мониторингу, поскольку использование молекулярных инструментов становится более доступным и по мере увеличения числа последовательностей 28S LSU для видов опылителей в общедоступных базах данных.

Образец цитирования: Дарби Б., Брайант Р., Келлер А., Йочим М., Мо Дж., Шрайнер З. и др. (2020) Молекулярное секвенирование и морфологическая идентификация выявляют аналогичные закономерности в местных сообществах пчел на государственных и частных пастбищах восточной части Северной Дакоты.PLoS ONE 15 (1):
e0227918.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227918

Редактор: Би-Сон Юэ, Сычуаньский университет, КИТАЙ

Поступило: 4 октября 2019 г .; Одобрена: 2 января 2020 г .; Опубликовано: 23 января 2020 г.

Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, модифицировать, надстраивать или иным образом использовать в любых законных целях.Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.

Доступность данных: необработанных считывания секвенирования были депонированы в архиве чтения последовательностей NCBI (связанном с идентификатором биопроекта PRJNA596302), и все данные, необходимые для воспроизведения анализов этой статьи, были отправлены в хранилище данных Dryad (doi: 10.5061 / dryad.vdncjsxqh).

Финансирование: RS, BD и MP получили финансирование от Геологической службы США (https: // www.usgs.gov/), номер гранта CESU-USGS G16AC00430. РС получил финансирование в рамках Соглашения о сотрудничестве NSF EPSCoR Track-1 (https://www.ndepscor.ndus.edu/) (Женщины в науке и технике), номер гранта OIA # 1355466. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Важность пчел и необходимость повсеместного мониторинга

Пчелы играют ключевую роль в функционировании измененных человеком и естественных экосистем, опыляя сельскохозяйственные культуры и сообщества дикорастущих растений [1].Почти четверть миллиона видов цветковых растений, включая многие ключевые культуры, нуждаются в насекомых и других животных для полового размножения [2]. Услуги по опылению, предоставляемые пчелами сельскому хозяйству по всему миру, оцениваются в 181 миллиард долларов США ежегодно [3]. В США беспокойство о диких и выращиваемых пчелах возросло в ответ на недавние сообщения об уменьшении видового разнообразия и популяционных тенденций [4–6]. Хотя появляющиеся данные свидетельствуют о систематическом сокращении численности местных пчел, в США отсутствует национальная программа мониторинга тенденций в популяциях местных пчел и состава сообществ опылителей в пространстве и времени.Отсутствие долгосрочного мониторинга для выявления изменений в демографических моделях видов или сдвигов в структуре пчелиных сообществ препятствует глобальным усилиям по сохранению опылителей [7]. Целевая группа по здоровью опылителей [8] продемонстрировала необходимость национальной программы мониторинга местных пчел, но разработка такой программы идет медленно из-за проблем с финансированием и многочисленных технических и логистических проблем.

Целевая группа по здоровью опылителей [8] призвала к согласованным усилиям по улучшению таксономической подготовки и выделению ресурсов на разработку более совершенных генетических и таксономических инструментов.Одним из основных препятствий на пути разработки национальной программы мониторинга местных пчел является ограниченное количество подготовленных систематиков, необходимых для выявления примерно 4000 видов пчел, обитающих в США. Отсутствие инструментов и систематиков для идентификации местных пчел представляет собой препятствие для национальной программы мониторинга и создает узкое место для других проектов исследования местных пчел по всей стране. Это особенно верно для исследовательских проектов, в которых используются пассивные методы отбора проб, такие как пчелиные миски [9] или ловушки Blue Vane, где огромное количество собранных образцов пчел не позволяет провести таксономическую идентификацию на более низком уровне.Морфологическая идентификация пчел требует значительных ресурсов и усилий. Определение вида зависит от мелких морфологических признаков, которые требуют обширной энтомологической подготовки и хорошо написанных дихотомических ключей (например, [10]). Образцы чеков также необходимо физически хранить в архивных условиях; Коллекции насекомых ограничены по площади, персоналу и финансированию [11]. Экологам, заинтересованным в проведении прикладных исследований местных пчел, часто приходится полагаться на ограниченное количество подготовленных систематиков для идентификации всех или подмножества образцов.Без обширных таксономических знаний исследователи должны быть вынуждены отказаться от проведения исследований сообществ более высокого уровня с различными видами обработки или среды обитания.

Молекулярная биология предоставляет многообещающий дополнительный набор методов для идентификации местных пчел и позволяет по-новому взглянуть на демографию пчел, предпочтения среды обитания и предпочтения в поисках пищи (например, [12–14]). Генетическая информация также может использоваться для оценки структуры популяции, уровней потока генов, генетического разнообразия и возникновения прошлых событий, таких как узкие места и изменения в связности [15].Использование молекулярных методов для идентификации пчел может устранить таксономические проблемы, мешающие экологическим исследованиям и мониторингу. Здесь мы использовали местных пчел, собранных на пастбищах в регионе Прейри-Холл в Северной Дакоте, США, чтобы создать конвейер генетической идентификации местных пчел Северной Дакоты. Эти методы применимы к другим экосистемам и вопросам, связанным с разнообразием опылителей, выходящих за рамки настоящего исследования.

До заселения европейцев регион прерий-выбоин представлял собой мозаику депрессивных заболоченных земель с высокотравными прериями на востоке и низкотравными прериями на западе [16].Хотя в этом регионе проводятся ограниченные исследования местных пчелиных сообществ, недавняя работа предполагает, что остатки пастбищ являются ценными средами обитания местных пчел [17–19]. Район прерий-выбоин, вероятно, является наиболее важным регионом страны для поддержки выращиваемых медоносных пчел [20]. Изменения в землепользовании, от пастбищ до пропашных культур, угрожают кормам для опылителей и среде обитания диких животных [21–22]; эти изменения усугубляются сокращением финансирования программ сохранения земель.

Охраняемые территории в регионе Прерий-Потхол находятся в федеральной, государственной и частной собственности.Например, Служба рыболовства и дикой природы США (USFWS) управляет более чем 180 000 гектарами государственных земель только в Северной Дакоте. Министерство сельского хозяйства США (USDA) управляет программами, которые стимулируют землевладельцев осуществлять природоохранные мероприятия на частных землях. Одна из таких программ, Программа сохранения заповедников (CRP), является крупнейшей программой по сохранению частных земель в США, в которой участвуют 9,2 млн и 0,52 млн га на национальном уровне и в Северной Дакоте, соответственно [23]. Программа CRP нацелена на маргинальные, экологически уязвимые сельскохозяйственные угодья, обеспечивая ежегодную арендную плату, если землевладелец забирает часть своей земли из выращивания сельскохозяйственных культур для создания защитного покрытия.Хотя государственные и частные природоохранные земли представляют собой потенциально важные среды обитания опылителей, было сделано на удивление мало работы по описанию того, как пчелиные сообщества различаются на этих территориях. Понимание различных, но взаимодополняющих ролей, которые частные и государственные заповедники играют в поддержке опылителей, является важной исходной информацией для управляющих природными ресурсами.

Целями этого проекта были разработка и тестирование конвейера молекулярного секвенирования, применяемого к местным сообществам пчел, отобранным на частных и государственных пастбищах в восточной части Северной Дакоты (Приложение S1).Идеальный конвейер молекулярной идентификации будет: а) нацеливаться на обычно используемый локус (или локусы), представленный множеством хорошо отобранных последовательностей в общедоступных базах данных, б) производить точные и точные идентификации, совместимые с морфологической идентификацией, и в) генерировать данные, которые одновременно являются качественными. (определение правильного количества видов) и количественное (определение правильного пропорционального представления видов). Чтобы проверить этот молекулярный конвейер, мы оценили таксономическое соответствие между традиционной морфологической идентификацией и молекулярным секвенированием> 20 000 собранных местных пчел.Мы также исследовали таксономическое разрешение, обеспечиваемое каждым методом, и обсудили сильные и слабые стороны молекулярного конвейера. Наконец, мы использовали каждый метод, чтобы выявить закономерности в структуре сообщества местных пчел, собранных на частных землях, включенных в CRP, и на государственных землях, существующих в качестве национальных заповедников дикой природы. Наши результаты обеспечивают основу для использования молекулярных методов для быстрой идентификации местных видов пчел в будущих исследованиях и мониторинге.

Методы

Сбор проб

В 2012 и 2013 годах было отобрано

сообществ опылителей с четырех парных пастбищ, называемых здесь «локациями», в районе прерий-выбоин в восточной части Северной Дакоты (рис. 1).Четыре местоположения были сосредоточены вокруг следующих земель Службы охраны рыболовства и дикой природы: Национальный заповедник дикой природы Эрроуд (47,2693 с.ш., -98,8522 з.д.), Район управления водно-болотными угодьями Теваукен (45,9980 с.ш., -97,3720 з.д.), Район управления водно-болотными угодьями Кульм (46,1475 с.ш., -99,2999 З. Д.) И национальный заповедник Салли-Хилл (47,9854 с.ш., -98,9782 з.д.). Каждое местоположение состояло из 1) естественных пастбищ прерий, расположенных на землях USFWS, находящихся под управлением системы адаптивного управления коренными прериями (NPAM), и 2) восстановленных пастбищ, включенных в CRP в частной собственности.Площадь участков составляла примерно 64 га, расстояние между ними составляло от 5 до 32 км. Пастбища CRP, включенные в это исследование, включали Практику по сохранению 1 (CP-1, Создание постоянно интродуцированных трав и бобовых), CP-2 (Создание постоянных местных трав) и CP-4D (Постоянная среда обитания дикой природы).

Рис. 1. Места проведения исследований в восточной части Северной Дакоты.

В каждом месте были выбраны два исследовательских участка: естественное пастбище прерий, расположенное на землях, управляемых Службой охраны рыболовства и дикой природы США, и прилегающие восстановленные пастбища прерий, включенные в Программу заповедников Министерства сельского хозяйства США.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227918.g001

На каждом участке NPAM и CRP было создано 20 трансектов на расстоянии не менее 65 метров друг от друга и в 5 метрах от ограждений, заболоченных территорий и лесополос. Данные о растительности собирались вдоль каждой трансекты, но здесь эти данные не приводятся. Пробы на трансектах отбирались примерно раз в две недели с мая по сентябрь в 2012 и 2013 годах, при этом образец состоял из одной без запаха синей лопаточной ловушки Springstar [24], размещенной на одном фиксированном конце трансекты на 24 часа.Каждую ловушку прикрепляли к 5-футовой арматурной стойке и подвешивали на стяжной проволоке длиной 6 дюймов, так что каждая пластинчатая ловушка находилась примерно на высоте ближайшей флоры. Образцы пластинчатых ловушек помещали в сосуды с помеченными крышками (с указанием даты, участка и номера разреза) и замораживали в Центре исследования дикой природы Северных прерий (NPWRC) после ежедневных полевых работ. Шмели-королевы и виды, находящиеся под угрозой исчезновения (например, Dakota Skipper, Hesperia dacotae ), обнаруженные в ловушке, были подсчитаны и выпущены перед удалением с места.Мы получили разрешение на выборку местных пчел на землях USFWS через Разрешение на специальное использование для исследований и мониторинга в каждом убежище USFWS. Мы получили устное разрешение от частных землевладельцев на опробование полей CRP.

Морфологическая идентификация

опылителей были идентифицированы до минимально возможного таксономического уровня в лаборатории беспозвоночных NPWRC в Джеймстауне, Северная Дакота. Установленные таксономические ключи [10] и онлайн-ресурсы (например, Bug Guide, Discover Life) использовались для идентификации образцов; подмножество образцов было проверено внешними экспертами.После подтверждения личности образцы были заархивированы в NPWRC, а некоторые из них представлены в Библиотеке опылителей Геологической службы США (https://www.npwrc.usgs.gov/pollinator/home). Хотя исходная идентификация была сделана для каждого разреза (т.е. каждого образца пластинчатой ​​ловушки), для целей настоящего исследования (и для соответствия данным молекулярного секвенирования) идентификаторы образцов были объединены по разрезу в пределах одного места.

Конвейер молекулярного секвенирования

Грунтовка дизайнерская.

Молекулярное секвенирование целых сообществ опылителей пчел с помощью высокопроизводительного секвенирования ампликонов требует праймеров, которые амплифицируют короткие ампликоны высоко вариабельных областей, фланкированных высококонсервативными областями.Вариабельные области необходимы для разделения видов, в то время как консервативные области необходимы для обеспечения одинаковой амплификации всех целевых таксонов с минимальным смещением амплификации по отношению к каким-либо определенным таксонам. Идеальные ампликоны должны иметь длину от 500 до 550 п.н., поскольку текущий химический состав MiSeq v3 допускает считывание парных концов 300 п.н. Максимальная длина чтения тогда составляет 600 п.н., но поскольку качество последних 50–75 нуклеотидов низкое, идеальный ампликон должен оставлять не менее 50–75 перекрывающихся оснований. К сожалению, локусы, которые наиболее вариабельны и также лучше всего представлены в общедоступных базах данных, такие как цитохромоксидаза I (COI; [25–26]), фактор элонгации 1-α (EF1-α; [27–28]) и wingless [28], по нашей оценке, не содержал сайтов связывания праймеров, которые были бы консервативными для всех видов пчел, а также приводили бы к ампликону размером менее 550 п.н.Вместо этого мы собрали и выровняли 500 последовательностей из NCBI для локуса 18S SSU и 28S LSU и идентифицировали по одной области в каждом гене: область V4-V5 малой субъединицы 18S (SSU, 555 п.н. в Apis mellifera ) и область D2 большой субъединицы 28S (LSU, 507 п.н. в Apis mellifera ). Эти области гена удовлетворяли всем трем требованиям к конструированию для данного применения: 1) сохранение последовательности в областях праймера, 2) высоко вариабельные последовательности между областями праймера и 3) ампликоны короче 600 п.н.

Подготовка проб.

Мы отобрали образцы каждого образца, чтобы учесть состав сообщества и внутривидовое генетическое разнообразие. По одной среднегрудной ножке от каждого образца помещали в микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл, представляющую его «сообщество» (каждое время с каждого поля пастбища, со всеми объединенными разрезами), а другую среднегрудную ножку от каждого образца помещали в микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл для представляющие его морфологически идентифицированные «таксоны». В результате было получено 224 пробирки для сообществ (состоящие из пула из одной ноги от каждого образца из каждого из 2 типов пастбищ x 4 местоположения x 28 дат отбора проб) и 56 пробирок таксонов (состоящих из пула из одной ноги от каждого образца, который был морфологически отнесены к этим таксонам).В некоторых случаях мы объединяли ноги из трубок двух или более таксонов, принадлежащих к разным семействам, чтобы минимизировать общее количество обработанных образцов. Мы добавили пять керамических шариков и две ножки мучного червя ( Tenebrio molitar ) в качестве межпробного контроля и 500 мкл буфера для геномного лизиса из 96-луночного набора тканей и клеток Qiagen в каждую пробирку. Ткань лизировали при комнатной температуре в течение ночи, затем промывали в течение 10 минут в TissueLyser перед тем, как продолжить выполнение рекомендуемых инструкций 96-луночного набора тканей и клеток Qiagen, которые включали связывание ДНК с силикагелем, 2-кратную промывку примесей и, наконец, элюирование ДНК в 60 мкл элюирующего буфера (EB), pH 8.0. В результате было получено 190 образцов ДНК (160 образцов от сообщества и 30 образцов таксонов), которые были случайным образом размещены в двух 96-луночных планшетах (с 90 образцами и шестью пробелами на планшет).

Подготовка библиотеки.

Первый раунд ПЦР проводили в отдельных реакций для каждого локуса с использованием праймеров BD0150 (5′ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACA GTGCGGTTAAAAAGCTCGTAGTTG 3 ‘) и BD0151 (5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACA GAACCATACTTCCCCCGGAAC 3 ‘) для 18S и BD0152 (5′ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACA GTGAAACCGTTCAGGGGTAAACC 3’ ) и BD0153 (5 ‘GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACA GGTGTTTCAAGACGGGTCCTG 3’) для 28S.Реакции ПЦР проводили в 96-луночных планшетах (1x буфер DreamTaq для ПЦР, 200 мкМ dNTP, 0,2 мкМ каждый праймер, 0,1 ед. Полимеразы DreamTaq, 2 мкл ДНК-матрицы) на термоциклере Applied Biosystems Veriti с начальной денатурацией при 95 ° C (1 мин. ), затем 30 циклов при 95 ° C в течение 0:30, 55 ° C в течение 0:30 и 72 ° C в течение 0:30 с последующим окончательным удлинением при 72 ° C в течение 5 минут. Для каждого планшета 10 мкл продукта ПЦР от амплификации 18S объединяли с 10 мкл продукта ПЦР от амплификации 28S и очищали с использованием 96-луночного набора Zymo PCR Cleanup.Мы использовали 2 мкл очищенного продукта в качестве матрицы для второго раунда ПЦР-амплификации с использованием праймеров с двойным индексированием и 8-нуклеотидными штрих-кодами Nextera (1x ПЦР-буфер DreamTaq, 200 мкМ dNTP, 0,1 мкМ каждый праймер, 0,1 мкМ полимеразы DreamTaq, 2 мкл ДНК-матрица) с начальной денатурацией при 95 ° C (1 мин), за которой следуют 8 циклов 95 ° C (30 с), 55 ° C (30 с) и 75 ° C (30 с), после чего следует заключительный удлинение при 72 ° C в течение 5 минут. Для каждого планшета объединяли 5 мкл продукта ПЦР второго раунда из каждого образца, очищали с помощью набора Purelink PCR Cleanup (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) и отправляли для секвенирования на секвенсоре MiSeq Gene & Small Genome Sequencer (MiSeq Reagent Kit v3). , Считывания 2×300 п.н .; Illumina, San Diego, CA), при этом каждый планшет секвенировали в отдельном прогоне MiSeq.

Анализ данных

Обработка чтения.

Мы получили более 22 миллионов проверенных на качество парных считываний из каждого цикла секвенирования. Эти парные чтения были объединены в одно чтение, отфильтрованы для удаления любых чтений с хотя бы одной предсказанной ошибкой [29] и дереплицированы с помощью команд USEARCH -fastq_mergepairs -fastq_filter -fastx_uniques [30–31]. Для образцов таксонов все последовательности не менее 10 считываний были сопоставлены с MUSCLE [32] и исследованы визуально в Geneious (Biomatters, Ltd., Новая Зеландия) для идентификации истинных биологических последовательностей, помимо химер и ошибок секвенирования. Предварительные усилия показали, что различные алгоритмы автоматической кластеризации и шумоподавления приблизились к идентификации истинных биологических последовательностей, но недостаточно надежно для наших целей. Для образцов сообщества все последовательности по крайней мере с 2 считываниями были сопоставлены с подтвержденными свободными от химер биологическими последовательностями, которые были подтверждены на образцах таксонов с использованием алгоритма «-otutab» программы USEARCH [33] с минимальной идентичностью 99%.Соответствия были занесены в таблицу с помощью специального скрипта Python / Biopython [34], чтобы отразить общее количество считываний, относящихся к каждому таксону, для каждого образца.

Количественное определение.

Идеальный трубопровод для молекулярного секвенирования должен быть не только качественным, но и количественным, давая оценки количества видов в дополнение к видовой принадлежности. Теоретически доля считываний секвенирования, приписываемых определенному виду, пропорциональна произведению числа особей этого вида, числа гаплоидных геномов в ткани от каждого индивидуума и числа копий гена рРНК на гаплоидный геном для этот вид.Однако на практике фактическая доля считываний секвенирования, приписываемых виду, также будет зависеть от полноты, с которой ДНК высвобождается из ткани (на которую может повлиять склеротизация кутикулы), а также от различных артефактов ПЦР, таких как образование химер (что должно происходить чаще, если вид встречается с близкородственными видами), дифференциальная эффективность амплификации или дифференциальная аффинность связывания (например, если место связывания праймера не сохраняется для всех видов).Тем не менее, даже если предположить, что высвобождение ДНК из ткани было полным (или, по крайней мере, эквивалентным для разных таксонов), и что артефакты ПЦР также отсутствовали или эквивалентны для всех таксонов, количество копий гена рРНК и количество гаплоидных геномов на Образец для каждого вида или своего рода «поправочный коэффициент для количества копий» должен быть известен, чтобы оценить пропорциональный состав образцов на основе только считываний секвенирования. Насколько нам известно, не существует аналитического решения этой проблемы, равно как и базы данных количества копий гена эукариотической рРНК, как для прокариот [35].Darby et al. [36] применили подход генетического алгоритма к численной оптимизации «поправочных коэффициентов» числа копий гена рРНК у почвенных нематод. Короче говоря, генетический алгоритм — это быстрый и высокопараллельный алгоритм «предположения и проверки», который генерирует несколько тысяч потенциальных решений поправочных коэффициентов для конкретных видов, каждый из которых используется для определения того, какие теоретические пропорции последовательности будут основаны на количество образцов и соответствующий коэффициент коррекции количества копий. Плохие решения (которые имеют низкое соответствие между ожидаемыми и фактическими пропорциями последовательности) удаляются на каждой итерации, в то время как хорошие решения (которые имеют высокое соответствие между ожидаемыми и фактическими пропорциями последовательности) дублируются и допускаются незначительные изменения, что позволяет генетическому алгоритму на каждой итерации развиваться в направлении оптимального решения поправочных коэффициентов, которые минимизируют суммы квадратов ошибок между ожидаемыми и фактическими данными.

Чтобы определить, можно ли сделать конвейер молекулярного секвенирования количественным, мы применили генетический алгоритм Darby et al. [36], чтобы сгенерировать поправочные коэффициенты числа копий рРНК для оценки пропорционального представительства каждого вида на основе числа пропорциональных считываний. Ключевым требованием этого подхода является наличие идентичных таксонов, представленных как в наборе данных на основе образцов, так и в наборе данных на основе последовательностей, поэтому мы идентифицировали 15 образцов, в которых роды, идентифицированные путем секвенирования, полностью соответствовали родам, идентифицированным по морфологии.Затем мы запустили генетический алгоритм для 10 000 000 итераций, используя 1000 геномов, все из которых начинались с оценки поправочного коэффициента 10 для каждого вида. На каждой итерации «геномы» (оценки поправочных коэффициентов) оценивались путем вычисления сумм квадратов ошибок (между наборами данных по количеству морфологически идентифицированных образцов и количеству считываний молекулярных последовательностей), и нижняя треть самых бедных геномов удалялась, а верхняя треть дублировалась. и разрешено мутировать на величину, взятую из нормального случайного распределения со стандартным отклонением 5.

Состав сообщества.

Численность и богатство опылителей пчел были смоделированы с помощью Обобщенной линейной смешанной модели для проверки влияния местоположения, типа управления (CRP против NPAM) и взаимодействия типа управления местоположением * на изобилие переменных отклика (образцов), морфологическое богатство (как определяется морфологической идентификацией образцов) и молекулярным богатством (как определено молекулярным секвенированием 28S LSU). Предполагалось, что все три ответные переменные получены из отрицательного биномиального распределения (смоделированного с помощью лог-ссылки).В случае численности каждая отдельная лопаточная ловушка использовалась в качестве члена ошибки (смоделирована как повторяющиеся измерения с авторегрессивными остатками первого порядка на стороне R). В случае обеих переменных богатства лопаточные ловушки были объединены в пределах даты отбора проб, так что дата отбора проб была термином ошибки.

Кривые накопления видов на основе выборки были рассчитаны с помощью iNEXT [37–38] с использованием данных присутствия-отсутствия как по морфологической идентификации образцов, так и по данным секвенирования 28S LSU, чтобы определить, различаются ли типы пастбищ по их общему прогнозируемому количеству видов.Анализ основных компонентов (PCA) был рассчитан с помощью пакета vegan R [39], чтобы определить, различается ли многомерный состав видов между типами пастбищ.

Результаты

Идентификация видов

Из 103 морфологически идентифицированных таксонов 75 были идентифицированы до одного вида, а 28 были идентифицированы до уровня рода или комплекса видов. Из этих морфологически идентифицированных образцов мы получили 87 уникальных молекулярных последовательностей из локуса 28S LSU и 45 уникальных молекулярных последовательностей из локуса 18S SSU.Последовательности 28S LSU были более способны различать таксоны, чем последовательности 18S SSU, поскольку медианное отличие от ближайшей проверенной последовательности для локуса 28S составляло 9 нуклеотидов в этом сообществе, но большинство уникальных последовательностей из локуса 18S находились в пределах всего 1 нуклеотида. следующих по сходству проверенных последовательностей 18S.

Было только десять случаев связи 1: 1 между одним морфологически идентифицированным таксоном и одной молекулярной последовательностью 28S LSU. Чаще всего было несколько морфологических таксонов, связанных с одной молекулярной последовательностью, несколько молекулярных последовательностей, связанных с одним морфологическим таксоном, или и то, и другое (Приложение S2).В некоторых случаях локус 28S был способен разрешить больше видов, чем морфологические идентификации. Например, морфология не смогла определить образцы рода « Nomada », но 28S ампликоны дали четыре различных последовательности, каждая из которых не менее чем из 22 нуклеотидов. Точно так же 28S-ампликоны разрешили четыре разные последовательности « Andrena », каждая из которых была по меньшей мере на 3 нуклеотида, отличающихся друг от друга, которые не были разрешены при первоначальной морфологической идентификации.Однако в некоторых случаях секвенирование локуса 28S приводило к меньшему количеству видов, чем морфологическая идентификация, часто частично из-за неоднозначности морфологической идентификации. Например, в то время как морфология сгруппировала экземпляры рода Ceratina в три группы (« C . calcarata» , « C . dupla» или « C . dupla / calcarata» ) , 28S ампликоны дали только две последовательности (API213 и API243), которые различались на 3 нуклеотида.Аналогичным образом, в то время как морфология сгруппировала экземпляры родов Eucera и Svastra в четыре таксона ( Eucera (Synhalonia) , Eucera NA, Svastra obliqua и две последовательности Svastra NA), получили только 28 последовательностей Svastra NA). (API217 и API235), которые различались 9 нуклеотидами.

Видовое богатство

Из 18 876 520 считываний из объединенных выборок сообщества (n = 124) 1 642 701 считывание прошли все проверки и проверки качества и были успешно сопоставлены с известной последовательностью пчел 28S (в результате среднее значение 12 667 считываний LSU на образец сообщества), а 1834 381 — пройденные чтения были сопоставлены с калибровочной последовательностью Beetle 28S.Точно так же 965 281 считывание с пройденным качеством было сопоставлено с известной последовательностью пчел 18S (в результате среднее значение 6857 считываний SSU на образец сообщества), в то время как 69 248 считываний с пройденным качеством были сопоставлены с калибровочной последовательностью 18S жука. Остальные считывания были отброшены как одиночные, химерные или непчелиные последовательности (локус 18S был достаточно консервативным для амплификации растительной ДНК).

Кривые разрежения видов для обоих молекулярных локусов (28S LSU и 18S SSU), по-видимому, приближаются к 124 образцам; дополнительная выборка из этой модели, вероятно, обнаружит несколько дополнительных видов (рис. 2).Хотя кажется, что морфологическая идентификация дала больше таксонов (103), чем секвенирование 28S LSU (87), многие морфологические таксоны, вероятно, были раздуты из-за присущих им трудностей морфологической идентификации в рамках большого многолетнего проекта. Например, после наблюдения нескольких тысяч экземпляров можно наблюдать новые признаки с течением времени, так что экземпляр, который вначале мог быть отнесен к одному таксону, мог быть идентифицирован как другой или, возможно, более конкретный таксон в конце проект.Однако таксоны, идентифицированные с помощью секвенирования 28S LSU, вероятно, будут более последовательными и надежными в течение всего периода отбора проб, поскольку нуклеотидные последовательности не меняются в течение всего проекта. Богатство молекулярных видов, полученное в результате этих 124 образцов сообществ, положительно коррелировало с видовым богатством, определенным морфологически (рис. 3, r = 0,7803, p <0,0001). Мы полагаем, что деградация ткани, вероятно, была основной причиной этих случаев неудачной амплификации ПЦР (см. Обсуждение).

Рис. 2. Сравнение темпов открытия видов.

Кривые разрежения, показывающие ожидаемое количество видов (вертикальная ось) по отношению к количеству единиц выборки (горизонтальная ось) для локуса 18S SSU, локуса 28S LSU и морфологические идентификации образцов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227918.g002

Рис. 3. Сравнение морфологических и молекулярных методов.

Корреляция между видовым богатством, определенным молекулярным секвенированием (вертикальная ось), и видовым богатством, определенным с помощью морфологической идентификации образцов (горизонтальная ось), как для Программы заповедников (CRP, кружки), так и для адаптивного управления аборигенными прериями (NPAM, треугольники) режимы управления.Каждый маркер представляет образец, сплошная линия представляет контрольную линию 1: 1, а пунктирная линия представляет эмпирическое наилучшее соответствие (r = 0,7803, p <0,0001).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227918.g003

Количественное определение

Из-за расхождений между молекулярными и морфологическими таксонами не удалось попробовать поправочные коэффициенты числа копий гена рРНК для всех таксонов из всех образцов. Вместо этого мы отобрали 15 образцов, в которых роды для морфологической идентификации полностью соответствовали родам из молекулярных образцов (которые оказались 15 родами пчел).Затем мы оценили поправочные коэффициенты числа копий гена рРНК для этих 15 родов пчел (плюс калибратор жуков), используя оптимизацию генетического алгоритма, предложенную Darby et al. [36]. После 10 000 000 поколений генетический алгоритм в конечном итоге сошелся с относительными поправочными коэффициентами, которые варьировались от 1х ( Hylaeus ) до 1248x ( Bombus ) (вставка на рис. 4). Это не обязательно количество копий гена рРНК на гаплоидный геном, а скорее обобщенный поправочный фактор, который включает как количество копий рРНК на гаплоидный геном, количество гаплоидных геномов на клетку, так и количество клеток в ткани ноги, которые были собраны из каждого гаплоидного генома. образец.Например, поправочный коэффициент для Lassioglossum составлял 30,0, что примерно вдвое больше поправочного коэффициента для Hoplitis (14,9), подразумевая, что одна ножка Lassioglossum будет иметь тенденцию давать примерно вдвое больше ампликонов, чем ножка из Hoplitis , и поэтому он будет непропорционально перепредставлен в выборке примерно в два раза больше, чем Hoplitis (но только на четверть от Megachile , который имеет поправочный коэффициент 124.5). Эти относительные поправочные коэффициенты затем ретроактивно применялись к данным подсчета считывания последовательностей для оценки прогнозируемого количества особей от каждого рода. Общая корреляция между прогнозируемой и фактической численностью всех родов из 15 отобранных образцов составила 0,8859 (95% ДИ: 0,8552–0,9104), и эта корреляция была наиболее сильной в четырех наиболее часто встречающихся таксонах: Agapostemon , Bombus , Hylaeus и Lasioglossum (рис. 5).

Рис 4.Результаты генетического алгоритма корректирующего фактора.

Верхние оценки поправочного коэффициента числа копий (горизонтальная ось) нанесены на график для каждого таксона (вертикальная ось) после восьми логарифмически разнесенных поколений генетического алгоритма (панели). Врезка: сводная таблица окончательных оценок поправочного коэффициента для каждого таксона.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227918.g004

Рис. 5. Количественное определение численности по счетчикам считываний.

Поправочные коэффициенты числа копий из генетического алгоритма (рис. 5) использовались для ретроактивной оценки численности (вертикальная ось) 15 таксонов пчел (здесь показаны четыре наиболее часто встречающихся таксона) относительно их фактического количества особей (горизонтальная ось).Каждый цвет маркера представляет отдельный таксон, пунктирная черная линия представляет (идеальную) контрольную линию 1: 1; каждая цветная линия представляет собой наиболее подходящий для этого таксон.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227918.g005

Состав сообщества

Тенденции численности пчел (собранных в пластинчатых ловушках) варьировались в зависимости от местоположения и взаимодействия местоположения * типа управления, но не по типу управления в качестве основного эффекта. (Таблица 1, Рис 6). Точно так же видовое богатство на дату отбора образцов варьировалось в зависимости от местоположения и взаимодействия местоположения * типа управления, но не в зависимости от типа управления в качестве основного эффекта, и это было верно как для морфологической идентификации, так и для молекулярных последовательностей (таблица 1, рис 6). .Кривые накопления видов были сопоставимы как для данных на основе образцов, так и для данных на основе последовательностей, поскольку оба показали, что по количеству собранных образцов местоположения Эрроувуд и Саллис-Хилл имели большее видовое богатство, чем местоположения Кульм или Теваукон, независимо от того, были ли они управление было CRP или NPAM (рис. 7). Аналогичным образом, анализ основных компонентов был сопоставим как для данных на основе образцов, так и для данных на основе последовательностей, поскольку оба показали, что многомерный состав образцов был более разным между точками отбора образцов и в значительной степени перекрывался (или нечетко) между типами управления (рис. 8).

Рис. 6. Изобилие и богатство пчел.

A) Среднее (± 95% ДИ) количество отдельных пчел, собранных в пластинчатые ловушки (вертикальная ось) во всех точках отбора проб за оба года (2012 и 2013), в четырех местах (Эрроувуд, Кульм, Саллис-Хилл и Теваукон) как для Программы заповедников (CRP), так и для пастбищ адаптивного управления естественными прериями (NPAM). B) Средняя (± 95% ДИ) численность пчел за день отбора проб (все лопаточные ловушки объединены вместе), полученная молекулярным секвенированием (28S LSU) и морфологией в четырех местах (Эрроувуд, Кульм, Саллис-Хилл и Теваукон) для обоих Программа заповедников (CRP) и адаптивное управление коренными прериями (NPAM).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227918.g006

Рис. 7. Кривые разрежения пород.

Кривые разрежения, показывающие ожидаемое количество видов по отношению к количеству единиц выборки (горизонтальная ось) для четырех местоположений (красный = Эрроувуд, зеленый = Кульм, синий = холм Салли, фиолетовый = Теваукон) и двух режимов управления (пунктирная линия) линии = CRP, сплошные линии = NPAM) на основе A) морфологической идентификации образца или B) молекулярного секвенирования 28S LSU.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227918.g007

Рис. 8. Распределение анализа основных компонентов.

Образцы пчел из типов пастбищ Программы природоохранных заповедников (CRP) и Native Prairie Adaptive Management (NPAM) в четырех местах (Эрроувуд, Кульм, Саллис-Хилл, Тевокон), нанесенные на график вдоль основного компонента 2 (вертикальная ось) и основного компонента 1 (горизонтальная ось) ) на основе A) морфологической идентификации образца или B) молекулярного секвенирования 28S LSU.Заштрихованная область представляет собой минимальный выпуклый многоугольник, охватывающий все образцы и все местоположения для данного режима управления.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227918.g008

Обсуждение

Исследования и мониторинг местных пчелиных сообществ ограничены ограниченным числом обученных систематиков и альтернативных инструментов для идентификации местных пчел [40]. Целью этого проекта было испытание конвейера молекулярного секвенирования, очень похожего на то же секвенирование ампликона, которое используется для характеристики микробных сообществ [41], грибов [42], протистов [43], нематод [36] и пыльцы, собранной пчелами [41]. 44].Наша первая цель состояла в том, чтобы нацеливаться на часто используемый локус, который уже имеет много хорошо отобранных последовательностей в общедоступных базах данных. Хотя мы не смогли учесть наиболее часто используемые локусы (такие как COI или EF1-α), мы действительно добились успеха с локусом рРНК 28S LSU, который имеет растущее число идентифицированных последовательностей в общедоступных базах данных, таких как NCBI и СИЛЬВА [45]. Наша вторая цель состояла в том, чтобы произвести точную идентификацию, которая согласуется с морфологической идентификацией.Мы обнаружили, что локус 28S LSU очень способен различать виды, а в некоторых случаях даже разрешал экземпляры загадочных видов или неоднозначных комплексов видов. Нашей конечной целью было получение данных, которые были как качественными (способными определить правильное количество видов), так и количественными (способными определять правильное пропорциональное представление видов). Здесь метод секвенирования ампликонов дал данные, которые были достаточно качественными (в том, что богатство видов на основе последовательностей положительно коррелировало с богатством видов на основе образцов), но, к сожалению, не были количественно точными.Невозможность точно определить количество людей в смешанном образце, вероятно, была связана с деградацией ткани и нуклеиновых кислот до амплификации ПЦР. Однако процедура расчета поправочных коэффициентов для таксона с использованием небольшого подмножества наиболее совпадающих выборок продемонстрировала, что высокий уровень количественной точности может быть возможен, если образцы свежие и обработаны вскоре после сбора. В целом, наши результаты подчеркивают потенциал молекулярного секвенирования для характеристики состава пчелиного сообщества с помощью масштабируемой, высокопроизводительной и воспроизводимой процедуры.Таким образом, исследования и мониторинг, направленные на отслеживание изменений присутствия / отсутствия пчел или их богатства в пространстве и времени, могут обнаружить, что молекулярное секвенирование является эффективным инструментом для быстрой обработки образцов пчел; дальнейшие уточнения повысят надежность этих подходов для отслеживания изменений численности видов в пространстве и времени.

Идентификация видов

Подход молекулярной идентификации может многое предложить исследованиям на уровне сообщества с точки зрения объективности и повторяемости.Идентификация образцов для реконструкции состава сообщества для большого количества образцов представляет собой другую задачу, чем идентификация образцов для альфа-таксономии или реконструкции филогении. В последнем случае исследователь обычно хорошо знаком с одним или несколькими таксонами и менее знаком с другими, отдаленно родственными таксонами. В этом случае исследователю часто необходимо потратить на эти образцы значительно больше времени и усилий, чтобы обнаружить новые виды или разрешить комплексы незнакомых видов.Однако в случае идентификации образцов в рамках проекта по составу сообщества оператору может быть отказано в том, чтобы тратить слишком много времени на идентификацию какого-либо одного образца, особенно если он кажется редким и не является значительной частью сообщества. Вот почему многие проекты по определению состава сообществ имеют две нежелательные характеристики: 1) несколько неоднозначных таксонов, которые представляют образцы, которые не были или не могли быть идентифицированы с той же степенью достоверности, что и другие образцы (часто в просторечии называемых «мусорными отходами»). ”Род), и 2) таксономическая идентификация определенных видов может иногда меняться на протяжении всего проекта, часто по мере того, как оператор (операторы) лучше знакомится с образцами или наблюдает за дополнительными признаками, которые всегда присутствовали, но ранее не наблюдались.Возможно, самым сильным аргументом в пользу определения образцов по составу сообщества путем секвенирования является то, что обе проблемы почти устранены. До тех пор, пока выбранный локус варьируется в достаточной степени, чтобы разрешить образцы на желаемом таксономическом уровне, их молекулярная последовательность будет точной, точной и стандартизированной в течение вероятного промежутка времени для такого проекта.

Мы обнаружили, что локус 28S LSU был успешным в определении видовой идентичности и был более различающим, чем локус 18S SSU, который мог бы определять только род или семейство.Локус 18S SSU был высококонсервативным в своих сайтах связывания праймеров, даже при амплификации растительной рРНК; использование этого локуса может быть полезным в другой таксономической шкале, позволяя идентифицировать насекомых на более широком уровне. Основным ограничением локуса 28S LSU является отсутствие большой базы данных полных и четко идентифицированных референсных последовательностей для большинства географических регионов. Хотя количество последовательностей в NCBI и SILVA становится все более доступным [45], мы не нашли ни одного из местных видов пчел Северной Дакоты в базе данных SILVA.Таким образом, долгосрочный проект мониторинга, который использует локус 28S LSU для высокопроизводительного секвенирования ампликонов, может потребовать дополнения доступных баз данных с попыткой секвенировать подмножество морфологически идентифицированных образцов.

Видовое богатство

Наше исследование показывает, что молекулярное секвенирование позволяет точно оценить видовое богатство, даже если полная справочная база данных недоступна для идентификации видов. В зависимости от целей мониторинга одной оценки видового богатства в отсутствие идентификации видов может быть достаточно.В нашем проекте оценки видового богатства положительно коррелировали между молекулярными и морфологическими методами (r = 0,7803, рис. 3). Некоторое несоответствие между молекулярным и морфологическим разнообразием видов было связано с неточностью морфологической идентификации, такой как кластеры нескольких морфологических таксонов (например, три морфологические группы « Ceratina calcarata» , « Ceratina dupla» и « Ceratina» dupla / calcarata », фактически давая только две молекулярные последовательности:« Ceratina calcarata » и« Ceratina dupla »).Остальное несоответствие между молекулярным и морфологическим разнообразием видов возникло из-за отсутствия ДНК, что привело к неудачной ПЦР-амплификации некоторых образцов (вероятно, из-за деградации ДНК в ткани образцов). В одном образце не было восстановленных молекулярных последовательностей, несмотря на 13 морфологических видов в исходном образце (рис. 3). Опять же, это, вероятно, было следствием либо деградации ткани во всех образцах, либо идиосинкразического сбоя экстракции, очистки или ПЦР-амплификации гДНК.Образцы были отобраны в 2012 и 2013 годах, идентифицированы морфологически, а затем сохранены замороженными при -20 ° C до тех пор, пока они не будут обработаны для молекулярного секвенирования в 2017 году. Число считываний с ног жуков (которые были взяты свежими непосредственно перед обработкой для выделения ДНК. ) гораздо больше, чем пчелы. Мы не считаем, что лапы жуков были намного больше, чем у большинства пчелиных ног, не имели явно большего количества клеток или что их было намного легче разрушить. Вместо этого мы считаем, что образцы пчел, должно быть, испытали некоторую деградацию тканей и нуклеиновых кислот с момента их первого отбора образцов до момента их обработки для экстракции ДНК.Таким образом, мы рекомендуем, чтобы в будущих усилиях по отбору проб и проектах мониторинга использовалась свежая ткань из недавно отобранных образцов, если цель состоит в том, чтобы охарактеризовать несколько образцов в сообществе с помощью молекулярного секвенирования ампликонов.

Количественное определение

Идеальный протокол молекулярного секвенирования с высокой пропускной способностью должен быть как качественным (точная идентификация образцов и положительная корреляция с общим видовым богатством сообщества), так и количественным (точно отражать пропорциональное представительство видов в сообществе).Относительно точная количественная оценка численности видов стала возможной благодаря применению поправочных коэффициентов, специфичных для таксонов, к методу молекулярной идентификации секвенирования ампликонов. Без поправочных коэффициентов этот метод не позволял оценить относительную численность каждого вида в сообществе по следующим причинам: 1) отсутствие соответствия 1: 1 между молекулярной и морфологической идентификацией видов, 2) невозможность представления некоторых видов из-за деградированной ткани. (как обсуждается в разделе «Видовое богатство»), и 3) что наиболее важно, природа используемого мультикопийного гена рРНК.Оперон рРНК (который содержит как локусы 18S SSU, так и локусы 28S LSU) встречается во множестве тандемных повторов и значительно различается по количеству копий между видами. Например, только у комаров число копий гена рРНК колеблется от 45 до 1023 [46]. Хотя верно, что число копий рРНК филогенетически автокоррелировано (близкородственные виды, как правило, имеют относительно схожее число копий рРНК), существуют вариации внутри рода и, возможно, даже внутри вида. Для высокопроизводительного конвейера молекулярной идентификации для количественной оценки относительной численности видов необходимо разработать поправочные коэффициенты для каждого таксона в сообществе.Эти поправочные коэффициенты будут учитывать как различное количество копий гена рРНК в гаплоидном геноме, так и количество клеток в той части ткани (например, ноги), из которой извлекается гДНК.

Мы вычислили такие поправочные коэффициенты, отобрав 15 образцов, наиболее согласованных между молекулярной и морфологической идентификацией, и применили процедуру оптимизации генетического алгоритма, предложенную Darby et al. [36] для получения поправочных коэффициентов для почвенных нематод в аналогичных обстоятельствах.В результате этого подхода были введены поправочные коэффициенты, которые успешно восстановили относительную численность четырех наиболее часто встречающихся таксонов. Однако поправочные коэффициенты были от посредственных до плохих при оценке относительной численности менее часто встречающихся таксонов. Тем не менее, эти данные показывают перспективу использования секвенирования ампликонов для получения количественных данных об относительной численности видов, но только при относительно строгих критериях. Во-первых, ткань, которая используется для экстракции гДНК, должна быть высокого качества и без деградации доступной ДНК.Мы рекомендуем обрабатывать образцы как можно скорее и с минимальным хранением даже в замороженном состоянии. Во-вторых, должен быть высокий уровень соответствия между данными молекулярного секвенирования и морфологически идентифицированным количеством образцов, которые используются в качестве эталонных обучающих данных для генетического алгоритма. Один из способов добиться этого может заключаться в том, чтобы сначала выполнить молекулярное секвенирование и идентификацию, а затем повторно посетить образцы для морфологической идентификации и подсчета после того, как список видов будет создан с использованием молекулярного секвенирования.Затем морфологические подсчеты могут использоваться в качестве самих количественных данных или использоваться в качестве обучающих данных для основанных на генетическом алгоритме оценок поправочных коэффициентов, которые будут применяться к другим образцам. Даже без количественного определения программы мониторинга в США продемонстрировали эффективность использования данных о встречаемости видов для вывода о крупномасштабных сдвигах в распределении диких животных позвоночных [47–49]. Хотя отслеживание изменений численности видов часто является предпочтительным стандартом для программ биологического мониторинга, заселенность видами может быть эффективным суррогатом [50].

Состав сообщества

Целевая группа по здоровью опылителей [8] призвала уделять больше внимания исследованиям на оценке роли государственных и частных земель в поддержании здоровья опылителей. Здесь мы показали, что структура сообщества местных пчел больше различалась в разных местах отбора проб (Эрроувуд, Кульм, Саллис-Хилл и Теваукон), чем в разных типах управления пастбищами (Программа заповедников и адаптивное управление в местных прериях). Это важно, учитывая, что недавнее снижение численности местных пчел отчасти объясняется преобразованием пастбищ, таких как CRP, в пропашные культуры [6].Наши результаты предполагают, что маргинальные сельхозугодья, включенные в ПКИ, могут стать жизнеспособной естественной средой обитания пчел на уровнях, аналогичных местным прериям.

Наши данные показали, что связь между численностью и богатством пчел в зависимости от типа пастбища зависела от места, где пчелы были пойманы в ловушку. Наблюдаемое нами взаимодействие «местоположение * управление» могло быть связано с различиями в управлении лугами, отобранными нами в зависимости от местоположения, или с местными ландшафтными эффектами. У местных пчел, которых мы наблюдали, есть множество жизненных особенностей, но в целом аборигенным пчелам требуется среда обитания и цветочные ресурсы для завершения своего жизненного цикла.Действительно, разнообразие аборигенных пчел и структура сети выше в районах с повышенной неоднородностью среды обитания и растительных ресурсов [51–52, 17]. Количественная оценка реакции пчел на доступность цветочных ресурсов для разных типов пастбищ выходила за рамки нашего текущего исследования, но будет в центре внимания последующих исследований. Здесь нам удалось показать, что молекулярное секвенирование дает пространственные закономерности в сообществах пастбищных пчел, аналогичные паттернам, обнаруженным с помощью традиционных морфологических определений.

Заключение и предлагаемый рабочий процесс

Целью этого проекта было испытание конвейера молекулярного секвенирования, чтобы увидеть, можно ли его использовать как часть долгосрочного отбора проб или мониторинга. Мы обнаружили, что метод секвенирования ампликонов качественно точно отражает богатство отобранного пчелиного сообщества и видовую принадлежность, особенно когда доступна тщательно подобранная база данных известных последовательностей 28S. Наконец, мы описали жизнеспособные шаги по улучшению количественного анализа путем применения поправочных коэффициентов и использования свежего материала.

Чтобы включить этот конвейер молекулярного секвенирования в крупномасштабную или долгосрочную программу мониторинга, мы рекомендуем следующие шаги, основанные на нашем опыте этого проекта: 1) собирать образцы с использованием пассивного или активного метода, чтобы общее количество человек на образец достаточно мал, чтобы одна нога из каждого образца поместилась в центрифужную пробирку объемом 2 мл; 2) вытащить одну среднегрудную ногу из каждого образца и объединить в образце в одну центрифужную пробирку объемом 2 мл, если это возможно, 3) извлекать гДНК с помощью лизиса ткани в течение ночи с последующим протоколом взлома и избегать замораживания ткани в течение длительного времени; 4) амплифицировать локус 28S LSU с помощью ПЦР и подготовить библиотеки со штрих-кодом для секвенирования 2×300 п.н. карта считывается в справочную базу данных или в OTU de novo, 6) используя список видов или OTU из каждого образца, подсчитывает образцы и проверяет данные секвенирования с морфологической идентификацией, и 7) использует подсчет образцов как количественный d ata, или в качестве обучающего набора данных для оценки поправочных коэффициентов считывания, если это необходимо.

Благодарности

Мы благодарим Сару Кларк, Эмили Сиполт и Сэма О’Делла за помощь в идентификации пчел и полевых исследованиях. Надя Нури разработала карту учебного участка. Мы ценим поддержку частных землевладельцев и USFWS за предоставление нам доступа к участкам исследования. Любое использование торговых марок, названий фирм или продуктов только в описательных целях и не означает одобрения со стороны правительства США.

Список литературы

1. 1.
   Кляйн А.М., Вайсьер Б.Э., Кейн Дж. Х., Штеффан-Девентер И., Каннингем С.А., Кремен С. и др.Значение опылителей в изменении ландшафтов мировых культур. Труды Королевского общества B: биологические науки. 2007. 274 (1608): 303–13. pmid: 17164193
2. 2.
   Национальный исследовательский совет. Статус опылителей в Северной Америке. Вашингтон, округ Колумбия: The National Academies Press; 2007. 326 с.
3. 3.
   Gallai N, Salles J-M, Settele J, Vaissière BE. Экономическая оценка уязвимости мирового сельского хозяйства в условиях сокращения количества опылителей. Экологическая экономика.2009. 68 (3): 810–21. https://doi.org/10.1016/j.ecolecon.2008.06.014.
4. 4.
   Cameron SA, Lozier JD, Strange JP, Koch JB, Cordes N, Solter LF и др. Модели повсеместного сокращения численности североамериканских шмелей. Труды Национальной академии наук. 2011. 108 (2): 662–7. pmid: 21199943
5. 5.
   Бартомеус I, Ашер Дж. С., Гиббс Дж., Данфорт Б. Н., Вагнер Д. Л., Хедтке С. М. и др. Исторические изменения пчел-опылителей на северо-востоке США связаны с общими экологическими признаками.Труды Национальной академии наук. 2013. 110 (12): 4656–60. pmid: 23487768
6. 6.
   Ко I, Лонсдорф Э.В., Уильямс Н.М., Бриттен С., Исаакс Р., Гиббс Дж. И др. Моделирование состояния, тенденций и воздействия численности диких пчел в США. Труды Национальной академии наук. 2016; 113 (1): 140–5. pmid: 26699460
7. 7.
   Гоулсон Д., Николлс Э., Ботиас С., Ротерей Э.Л. Снижение численности пчел вызвано комбинированным стрессом от паразитов, пестицидов и отсутствия цветов.Наука. 2015; 347 (6229): 1255957. pmid: 25721506
8. 8.
   Целевая группа по опылителям. План действий по исследованию опылителей на 2015 г. Доступно по адресу: http://www.whitehouse.gov/sites/default/files/microsites/ostp/pollinator_research_action_plan_2015.pdf.
9. 9.
   Droege S, Tepedino VJ, Lebuhn G, Link W, Minckley RL, Chen Q, et al. Пространственные закономерности отлова пчел в ходе исследований по отлову чаш в Северной Америке. Сохранение и разнообразие насекомых. 2010. 3 (1): 15–23.
10. 10.Michener CD. Пчелы мира: издательство Университета Джона Хопкинса; 2007.
11. 11.
    Уиллер В. Что бы сделало НАСА? Критически важная инфраструктура для исследования видов. Систематика и биоразнообразие. 2010. 8 (1): 11–5.
12. 12.
    Джа С., Кремен С. Разнообразие ресурсов и однородность на уровне ландшафта стимулируют добычу кормов местными пчелами. Труды Национальной академии наук. 2013. 110 (2): 555–8. pmid: 23267118
13. 13.
    McArt SH, Urbanowicz C, McCoshum S, Irwin RE, Adler LS.Предикторы ландшафта распространенности патогенов и сокращения ареала у американских шмелей. Труды Королевского общества B: биологические науки. 2017; 284 (1867): 20172181. pmid: 29142119
14. 14.
    Ваудо А.Д., Фриц М.Л., Лопес-Урибе М.М. Открывая дверь в прошлое: доступ к филогенетическим, патогенетическим и популяционным данным от музейных пчел. Систематика и разнообразие насекомых. 2018; 2 (5).
15. 15.
    Лозье Дж. Д., Зайед А. Сохранение пчел в эпоху геномики. Сохранение генетики.2017; 18 (3): 713–29.
16. 16.
    Johnson WC, Millett BV, Gilmanov T., Voldseth RA, Guntenspergen GR и Naugle DE. Уязвимость водно-болотных угодий северных прерий к изменению климата. Биология. 2005; 55: 863–872
17. 17.
    Отто CRV, О’Делл С., Брайант Р.Б., Юлисс Н.Х. мл., Буш Р.М., Смарт-доктор. Использование общедоступных данных для количественной оценки взаимодействий растений и опылителей и оценки природоохранных смесей семян на Великих северных равнинах. Экологическая энтомология. 2017; 46 (3): 565–78.pmid: 28472369
18. 18.
    Evans E, Smart M, Cariveau D, Spivak M. Wild, местные пчелы и выращиваемые медоносные пчелы получают выгоду от аналогичного использования сельскохозяйственных угодий. Сельское хозяйство, экосистемы и окружающая среда. 2018; 268: 162–70. https://doi.org/10.1016/j.agee.2018.09.014.
19. 19.
    Бендель Ч.Р., Крал-О’Брайен К.С., Ховик Т.Дж., Лимб Р.Ф., Хармон Дж. П. Сети растений – опылителей в рабочих ландшафтах пастбищ показывают сезонные сдвиги в структуре и составе сети. Экосфера. 2019; 10 (1): e02569.
20. 20.
    Отто CRV, Roth CL, Carlson BL, Smart MD. Изменение землепользования снижает пригодность среды обитания для содержания управляемых семей медоносных пчел на Северных Великих равнинах. Труды Национальной академии наук. 2016. 113 (37): 10430–5. pmid: 27573824
21. 21.
    Отто CRV, Чжэн Х., Галлант А.Л., Иованна Р., Карлсон Б.Л., Смарт М.Д. и др. Прошлая роль и перспективы Программы сохранения медоносных пчел на Великих равнинах. Труды Национальной академии наук.2018; 115 (29): 7629–34. pmid: 29967144
22. 22.
    Дюрант Дж. Л., Отто CRV. Чувствуете укус? Устранение изменений в землепользовании может смягчить сокращение численности пчел. Политика землепользования. 2019; 87: 104005. https://doi.org/10.1016/j.landusepol.2019.05.024.
23. 23.
    Агентство фермерских услуг. Статистика программы заповедников на 2019 год [2 октября 2019 г.]. Доступно по адресу: https://www.fsa.usda.gov/programs-and-services/conservation-programs/reports-and-statistics/conservation-reserve-program-statistics/index.
24. 24.
    Стивен В.П., Рао С. Цветные ловушки без запаха для пчел, не являющихся пчелами Apis (Hymenoptera: Apiformes). Журнал Канзасского энтомологического общества. 2005; 78 (4): 373–80, 8.
25. 25.
    Данфорт Б.Н. Филогения пчел рода Lasioglossum (Hymenoptera: Halictidae) на основе данных о митохондриальной последовательности COI. Систематическая энтомология. 1999; 24 (4): 377–93.
26. 26.
    Мардулин П., Уитфилд Дж. Б. Филогенетический сигнал в генах COI, 16S и 28S для определения родства между родами Microgastrinae (Hymenoptera; Braconidae): свидетельство высокой степени диверсификации в этой группе паразитоидов.Молекулярная филогенетика и эволюция. 1999. 12 (3): 282–94. pmid: 10413623
27. 27.
    Ариас MC, Шеппард WS. Филогенетические отношения медоносных пчел (Hymenoptera: Apinae: Apini), полученные на основе данных о последовательностях ядерной и митохондриальной ДНК. Молекулярная филогенетика и эволюция. 2005. 37 (1): 25–35. pmid: 16182149
28. 28.
    Патини С., Мишез Д., Данфорт Б.Н. Филогенетические отношения и эволюция растения-хозяина в базальной кладе Halictidae (Hymenoptera, Apoidea).Кладистика. 2008. 24 (3): 255–69.
29. 29.
    Эдгар Р.С., Фливбьерг Х. Фильтрация ошибок, сборка пар и исправление ошибок для чтения секвенирования следующего поколения. Биоинформатика. 2015; 31 (21): 3476–82. pmid: 26139637
30. 30.
    Эдгар RC. Поиск и кластеризация на порядки быстрее, чем BLAST. Биоинформатика. 2010. 26 (19): 2460–1. pmid: 20709691
31. 31.
    Эдгар RC. UPARSE: высокоточные последовательности OTU, полученные при считывании микробного ампликона. Методы природы.2013; 10: 996. pmid: 23955772
32. 32.
    Эдгар RC. MUSCLE: метод множественного выравнивания последовательностей с уменьшенной временной и пространственной сложностью. BMC Bioinformatics. 2004; 5 (1): 113. pmid: 15318951
33. 33.
    Эдгар RC. UNOISE2: улучшенное исправление ошибок при секвенировании ампликонов Illumina 16S и ITS. bioRxiv. 2016: 081257.
34. 34.
    Cock PJA, Antao T, Chang JT, Chapman BA, Cox CJ, Dalke A и др. Biopython: свободно доступные инструменты Python для вычислительной молекулярной биологии и биоинформатики.Биоинформатика. 2009. 25 (11): 1422–3. pmid: 19304878
35. 35.
    Стоддард С.Ф., Смит Б.Дж., Хайн Р., Роллер BRK, Шмидт TM. rrnDB: улучшенные инструменты для интерпретации изобилия генов рРНК у бактерий и архей и новая основа для будущего развития. Исследования нуклеиновых кислот. 2014. pmid: 25414355
36. 36.
    Дарби Б.Дж., Тодд Т.К., Герман Массачусетс. Высокопроизводительное секвенирование ампликонов генов рРНК требует корректировки числа копий, чтобы точно отразить влияние методов управления на структуру сообщества почвенных нематод.Молекулярная экология. 2013; 22: 5456–71. pmid: 24103081
37. 37.
    Hsieh TC, Ma KH, Chao A. iNEXT: пакет R для разрежения и экстраполяции видового разнообразия (числа Хилла). Методы экологии и эволюции. 2016; 7 (12): 1451–6.
38. 38.
    Чао А., Готелли, штат Нью-Джерси, Се Т.С., Сандер Э.Л., Ма К.Х., Колвелл Р.К. и др. Редкость и экстраполяция с числами Хилла: основа для выборки и оценки в исследованиях видового разнообразия. Экологические монографии. 2014. 84 (1): 45–67.
39. 39.
    Оксанен Дж., Бланше Ф.Г., Киндт Р., Лежандр П., Минчин П., О’Хара Р. Б. и др. Веган: Пакет «Экология сообщества». Версия пакета R. 2.0–10. КРАН. 2013.
40. 40.
    Samways MJ. Насекомые в сохранении биоразнообразия: некоторые перспективы и направления. Биоразнообразие и сохранение. 1993. 2 (3): 258–82.
41. 41.
    Капорасо Дж. Г., Лаубер С. Л., Уолтерс В. А., Берг-Лайонс Д., Хантли Дж., Фирер Н. и др. Сверхвысокопроизводительный анализ микробного сообщества на платформах Illumina HiSeq и MiSeq.ISME J. 2012; 6 (8): 1621–4. pmid: 22402401
42. 42.
    Ихрмарк К., Бёдекер ИТМ, Крус-Мартинес К., Фриберг Х., Кубартова А., Шенк Дж. И др. Новые праймеры для амплификации грибковой области ITS2 — оценка с помощью секвенирования 454 искусственных и естественных сообществ. Женская микробиология, экология. 2012; 82 (3): 666–77. pmid: 22738186
43. 43.
    Амарал-Зеттлер Л.А., МакКлимент Е.А., Утка Х.В., Хьюз С.М. Метод изучения разнообразия протистана с использованием массивно параллельного секвенирования гипервариабельных участков V9 малых субъединичных генов рибосомной РНК.PLoS ONE. 2009; 4 (7): e6372. pmid: 19633714
44. 44.
    Смарт MD, Корнман Р.С., Иванович Д.Д., Макдермотт-Кубечко М., Петтис Дж.С., Спивак М.С. и др. Сравнение пыльцы, собранной пчелами на сельскохозяйственных угодьях, с использованием световой микроскопии и метабаркодирования ITS. Экологическая энтомология. 2017; 46 (1): 38–49. pmid: 28062536
45. 45.
    Pruesse E, Quast C, Knittel K, Fuchs BM, Ludwig W, Peplies Jr и др. SILVA: всеобъемлющий онлайн-ресурс для проверенных и согласованных данных о последовательностях рибосомных РНК, совместимых с ARB.Исследования нуклеиновых кислот. 2007. 35 (21): 7188–96. pmid: 17947321
46. 46.
    Кумар А, Рай К. Хромосомная локализация и число копий генов рибосомной РНК 18s + 28S у эволюционно разнообразных комаров (Diptera, Culicidae). Наследие. 1990. 113 (3): 277–89. pmid: 2093704
47. 47.
    Донован TM, Flather CH. Взаимосвязь между тенденциями развития певчих птиц Северной Америки, фрагментацией среды обитания и заселенностью ландшафта. Экологические приложения. 2002. 12 (2): 364–74.
48. 48.Grant EHC, Miller DAW, Schmidt BR, Adams MJ, Amburgey SM, Chambert T. и др. Количественные данные о влиянии нескольких водителей на сокращение численности амфибий в континентальном масштабе. Научные отчеты. 2016; 6: 25625. pmid: 27212145
49. 49.
    Маккензи Д.И., Николс Дж. Д., Ройл Дж. А., Поллок К. Х., Бейли Л. Л., Хайнс Дж. Э. Оценка и моделирование заселенности: выведение закономерностей и динамики появления видов. Берлингтон, Массачусетс: Elsevier / Academic Press; 2006.
50. 50.
    Йоккос Н.Г., Николс Д.Д., Булинье Т.Мониторинг биологического разнообразия в пространстве и времени. Тенденции в экологии и эволюции. 2001. 16 (8): 446–53.
51. 51.
    Поттс С.Г., Вуллиами Б., Дафни А., Нееман Дж., Уиллмер П. Связь пчел и цветов: как цветочные сообщества структурируют сообщества опылителей? Экология. 2003. 84 (10): 2628–42.
52. 52.
    Уильямс Н.М., Уорд К.Л., Поуп Н., Исаакс Р., Уилсон Дж., Мэй Э.А. и др. Местные насаждения полевых цветов поддерживают изобилие и разнообразие диких пчел в сельскохозяйственных ландшафтах Соединенных Штатов.Экологические приложения. 2015; 25 (8): 2119–31. pmid: 26

    3

Цифровая визуализация / морфология — следующая глава в гематологии

Цифровая визуализация / морфология использует цифровые изображения и программные алгоритмы для классификации гематологических клеток, таких как лейкоциты и эритроциты. Для подгруппы лейкоцитов классификация цифровой системы хорошо коррелирует с методом ручного микроскопа, золотым стандартом. Таким образом, цифровая визуализация приводит к более быстрому, более эффективному и стандартизированному способу выполнения морфологического анализа мазка периферической крови.Возможные будущие приложения включают морфологический анализ других категорий клеток, таких как эритроциты и тромбоциты, и цифровой анализ других материалов, таких как образцы костного мозга.

Кроме того, цифровое изображение можно использовать как отличный инструмент обучения. Производители систем цифровой микроскопии должны проводить независимые исследования качества, чтобы обеспечить соблюдение требований к качеству. Интеграция цифровых изображений с результатами основного счетчика клеток может привести к более быстрому обнаружению и более высокой чувствительности и специфичности при обнаружении гематологических злокачественных новообразований.

Морфологический анализ мазка периферической крови (ФБК) — важный элемент гематологической диагностики. ¹ Традиционно анализ PBS проводился с использованием метода ручного микроскопа. Однако этот метод трудоемок, требует непрерывного обучения персонала и подвержен относительно большой вариативности между наблюдателями. ^2-4 Разработка цифровых микроскопов, способных использовать цифровые изображения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов для классификации, продолжается уже более десяти лет. ^4,5

Для наглядности в этом обзоре будут обсуждаться цифровые изображения с использованием цифрового микроскопа, разработанного компанией Cellavision. Корпорация Sysmex создала аналогичный цифровой микроскоп, интегрированный в гематологический трекер, включающий как счетчик клеток, так и устройство для окрашивания слайдов. ²⁶ Другие компании создали системы цифровой микроскопии, ^6,7,27 , особенно в области патологии. ⁸ Однако эти системы все еще находятся в экспериментальной фазе в отношении внедрения в рутинную (гематологическую) диагностику и в настоящее время больше используются для удаленной диагностики и использования в научных целях.По сути, теперь они не используются в качестве фильтров патологии при диагностике. Однако некоторые системы заняли центральное место в рутинном гематологическом скрининге мазков периферической крови.

Цифровой рабочий процесс в деталях

В цифровом микроскопе (DM) используется цифровая камера, способная создавать изображения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов с высоким разрешением. Системы оснащены программным обеспечением, способным не только обнаруживать эти клетки, но и впоследствии классифицировать их по правильному классу клеток.Это программное приложение было разработано с использованием искусственной нейронной сети и учитывает большое количество характеристик, таких как размер, округлость, размер и форма ядра, для морфологической классификации лейкоцитов. Количество ячеек, подсчитываемых системой, может быть установлено оператором, и DM представит результаты как в абсолютных числах, так и в процентах. Затем о результатах классификации может судить опытный техник-морфолог. Эксперт подтвердит результаты и отправит их в информационную систему лаборатории (ЛИС) и информационную систему больницы (ИСЗ).В данной статье классификация системой без ручного вмешательства будет определяться как предварительная классификация. Последующая возможная переклассификация обученным морфологом будет определена как постклассификация.

Прежде чем системы цифровой микроскопии могут быть внедрены в повседневную гематологическую практику в отношении анализа PBS, эти системы должны быть тщательно проверены. В настоящее время стандартным считается метод ручного микроскопа. На сегодняшний день в различных статьях описываются исследования точности и точности цифровых изображений по сравнению с ручной оценкой.Было показано, что цифровая микроскопия показывает хорошую корреляцию со стандартом в отношении пятичастичного дифференциала: сегментированные, эозинофильные и базофильные гранулоциты;
лимфоцитов; и моноциты. Ядерные эритроциты (NRBC) также показали хорошую корреляцию. ^9-11

Кроме того, цифровая визуализация позволяет получить воспроизводимые результаты при сравнении результатов независимо управляемых цифровых микроскопических систем того же типа и марки. ¹² Предварительная классификация незрелых гранулоцитов и миелоидных клеток-предшественников показала неадекватную корреляцию с ручным методом, требующим ручного контроля для обеспечения правильных результатов.Поэтому математический алгоритм классификации этих классов требует дальнейшего совершенствования. Однако можно утверждать, что в клинической ситуации единственного описания сдвига влево достаточно для диагностики и не обязательно требует особой подклассификации отдельных миелоидных клеток-предшественников. Сочетание этого с современными функциями незрелых гранулоцитов на счетчиках клеток может помочь в решении этой проблемы.

Патология лимфоцитов

Правильная подклассификация патологии конкретной клонной подмножества, e.например, фолликулярная лимфома (FCL) или лимфома из мантийных клеток (MCL) в случае наличия аномальных классов злокачественных лимфоцитов в настоящее время также все еще отсутствует. Однако в последнее время в этой конкретной области были достигнуты успехи. Алферес и др. Разработали алгоритмы, позволяющие отличить волосатые клетки и клетки хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) от нормальных лимфоцитов с использованием анализа цифровых изображений. ¹³ Кажется вероятным, что дальнейшее совершенствование этих алгоритмов облегчит обнаружение и классификацию патологических клеток в ближайшем будущем.

Бластные клетки

Несколько исследований показали высокую чувствительность обнаружения бластных клеток в PBS с использованием цифровых изображений. ^10,11 К сожалению, это сопровождалось относительно низкими показателями специфичности в предварительной классификации, в результате чего окончательный результат все еще подлежал проверке опытным наблюдателем вручную. ¹¹ Однако высокая чувствительность делает цифровую визуализацию чрезвычайно подходящей в качестве инструмента скрининга на наличие бластных клеток в PBS.Это, например, очень полезно при наблюдении за пациентами с миелодиспластическим синдромом (МДС) и острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) во время терапевтического лечения, и наша лаборатория уже несколько лет использует эту особенность с удовлетворительными результатами.

Тромбоциты

Что касается количества тромбоцитов, цифровая визуализация хорошо коррелирует как с ручными результатами, так и с результатами счетчика клеток. ¹⁴ Анализ морфологии тромбоцитов (например, гранулярности) с использованием цифровых изображений, тем не менее, все еще продолжается.Это развитие может оказаться клинически значимым. Например, мы знаем, что у пациентов с эссенциальным тромбоцитозом (ET, MPN) могут наблюдаться морфологические аберрантные тромбоциты в отсутствие абсолютного повышенного количества тромбоцитов (в настоящее время пороговая точка для диагностики ET составляет> 450 x 109 / л как одна из основные критерии).

Морфология красных кровяных телец

Недавние успехи были также достигнуты в области морфологии эритроцитов с использованием цифровых изображений. Усовершенствованный модуль RBC генерирует от 2000 до 4000 отдельных изображений эритроцитов.Впоследствии системы классифицируют клетки на основе различных морфологических алгоритмов, сравнимых с методом классификации лейкоцитов из пяти частей.

Первые шаги к стандартизации морфологического анализа линии эритроцитов с использованием цифровых изображений были сделаны недавно. Недавние исследования с использованием морфологического модуля эритроцитов показывают более низкие коэффициенты вариации внутри цикла, между запусками и между наблюдателями при подсчете шистоцитов по сравнению с коэффициентами, наблюдаемыми при ручной оценке.Оба исследования Hervent et al и Egele et al показывают, что цифровая визуализация переоценивает процент шистоцитов в предварительной классификации, что приводит к высокой чувствительности. ^15,16 Однако последующая низкая специфичность подчеркивает необходимость постклассификационного / ручного контроля.

Переоценка также наблюдается в предварительной классификации клеток слезы, например, при миелопролиферативных заболеваниях (то есть миелофиброзе). ¹⁷ Было также показано, что обнаружение включений возможно с помощью цифровых изображений.Исследование Racsa et al. Демонстрирует, что цифровая визуализация может обнаруживать внутриклеточных паразитов при рутинном скрининге мазков крови на морфологию эритроцитов. ¹⁸ Тельца Хауэл-Джолли также могут быть обнаружены системами, а Револ и др. Недавно даже использовали машины для цифровой визуализации для количественной оценки включений, подобных телу Хауэл-Джолли, в нейтрофилах как возможного предиктора токсичности ганцикловира. ¹⁹ Кроме того, цифровая микроскопия эритроцитов успешно используется в качестве скринингового инструмента для диагностики наследственной гемолитической анемии. ²⁸

Эти последние, конкретные приложения цифровой визуализации, однако, в настоящее время не одобрены FDA, и лежащие в основе алгоритмы обнаружения и принятия решений нуждаются в дальнейшем улучшении, прежде чем эти модули можно будет безопасно внедрить в повседневную диагностику.

Интеграция в повседневную практику

Внедрение цифровых микроскопов, встроенных в системы полной автоматизации лаборатории (то есть в сочетании со счетчиками клеток и окрашивающими устройствами для создания слайдов), открывает путь для реализации модулей клинических решений путем объединения результатов счетчика клеток с результатами цифровой визуализации. ⁵ Это, несомненно, приведет к более высокой чувствительности и специфичности при обнаружении и классификации гематологических заболеваний. Однако, прежде чем мы достигнем этой стадии разработки, необходимо будет выполнить несколько требований. Одно из этих требований — непрерывная круглосуточная надлежащая подготовка проб.

Хорошее качество подготовки слайдов / образцов играет ключевую роль в хорошем обнаружении и последующей классификации лейкоцитов и эритроцитов с использованием цифровых изображений. Например, системы цифровой визуализации испытывают трудности с отделением нейтрофильных гранулоцитов от базофильных гранулоцитов, когда окрашивание недостаточно качественное и становится слишком темным.Слайды, подготовленные вручную, имеют недостаточное качество, чтобы обеспечить хорошую воспроизводимую классификацию. Полуавтоматические и полностью автоматизированные системы подготовки слайдов и окрашивания (окрашивание по Май Грюнвальду Гимза или Райту) являются предпочтительными методами выбора.

Подводя итог, можно сказать, что цифровая визуализация работает для нескольких классов клеток при классификации лейкоцитов и эритроцитов в мазках периферической крови. Автоматический анализ биологических жидкостей также был исследован.20 Результаты как спинномозговой жидкости, так и других биологических жидкостей (включая абдоминальные жидкости / асцит и CAPD) показывают хорошую и клинически приемлемую точность при сравнении автоматического морфологического анализа с использованием цифрового изображения с ручным методом.Даже предварительная классификация подходит для большинства категорий жидкостей организма. Однако большим недостатком автоматизированного цифрового анализа биологических жидкостей является отсутствие распознавания определенных определенных категорий. Например, система в настоящее время неспособна обнаруживать и классифицировать мезотелиальные клетки, и возможные присутствующие опухолевые клетки часто находятся в категории «другие» (подкатегория, присутствующая в модуле жидкости организма). Еще один недостаток — время анализа; Автоматический цифровой анализ биологических жидкостей по-прежнему требует значительной ручной коррекции и, следовательно, занимает больше времени, чем полная классификация, проводимая вручную.Перед тем, как этот модуль можно будет полностью интегрировать в рутинный процесс диагностики биологических жидкостей, необходимо усовершенствовать существующие цифровые приложения для определения биологических жидкостей.

Цифровые изображения уже использовались в научных целях задолго до появления систем цифровой микроскопии. С появлением таких систем применение цифровых изображений в образовательных учреждениях значительно расширилось. Атласы клеток и даже мобильные приложения были созданы для обучения студентов различным нормальным и патологическим классам клеток, которые можно найти как в PBS, так и в биологических жидкостях.Снимки классифицированных или предварительно классифицированных клеток можно отправить коллегам по всему миру для получения второго мнения или поделиться редко встречающимися заболеваниями. Можно даже представить, что модули визуализации, способные к предварительной классификации, могут отправлять свои результаты предварительной классификации в центральное место для последующей классификации. Это было бы очень полезно для больниц с небольшими объемами PBS, которым трудно поддерживать морфологическую экспертизу.

Проблемы обследования качества цифровых изображений

Будь то ручная микроскопия или цифровая визуализация, качественная подготовка слайдов и окрашивание остаются и будут важными.Цифровые изображения уже открыли возможность для качественных исследований задолго до того, как были созданы, реализованы и коммерциализированы системы цифровой визуализации, способные предварительно классифицировать классы клеток. ^21-23 Также стало очевидным коммерческое использование таких обследований качества. ²³ В модуле качества обычно используется оцифрованный слайд, который можно загрузить через Интернет. Затем техники могут классифицировать лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. Затем результаты сравниваются с золотым стандартом, которым обычно является клинический химик или патолог.Затем баллы можно использовать для определения потенциальных возможностей обучения для отдельных лаборантов. В области гематоморфологии было бы очень полезно, если бы независимое учреждение цифровых слайдов с контролем качества полностью внедрило цифровые исследования качества в качестве стандартного обязательного требования. Поэтому коммерческим организациям следует объединить усилия с местными учреждениями по качеству морфологии, чтобы вывести цифровой контроль качества на новый уровень.

Интеграция цифровых изображений с результатами стандартного счетчика клеток

Следующим шагом в гематологии станет внедрение результатов цифровой визуализации с обычными результатами счетчика клеток.Несколько компаний уже подхватили эту идею. ^5,24 Пациенты могут получить большую пользу от интеграции, особенно при обнаружении патологии, требующей немедленного медицинского вмешательства. Например, для диагностики тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТП) требуется быстрое выявление и последующее лечение. ²⁵ Модуль клинической диагностики должен включать быстрое обнаружение (гемолитической) анемии в сочетании с тромбоцитопенией на счетчике клеток. На основе этих параметров и возможных контрольных отметок клеток для фрагментированных эритроцитов будет создано слайд.Затем это может быть автоматически проанализировано на наличие шистоцитов / фрагментоцитов с помощью цифровой визуализации. Текущие пороговые значения до классификации могут использоваться для предупреждения лабораторного персонала в случае превышения. Так, например, значение гемоглобина 9 г / дл у 35-летней женщины с числом тромбоцитов 25 x 109 / л в сочетании с результатом предварительной классификации 10 процентов шистоцитов должно быть представлено системой как высокоприоритетный дифференциал.

Это только один из множества возможностей, которые могут предоставить эти системы.Обнаружение большинства гематологических злокачественных новообразований, будь то MDS / AML или MPN, выиграет от структурной интеграции результатов счетчика клеток с цифровой визуализацией. Диагностические машины, такие как гематологические счетчики клеток и цифровые микроскопы, должны использоваться в качестве фильтров патологии, чтобы отфильтровать заболевания и отличить пациентов от пациентов, не являющихся пациентами. Последующая дополнительная диагностика, такая как проточная цитометрия, молекулярное и цитогенетическое тестирование (на образцах периферической крови или костного мозга), может затем использоваться для окончательной постановки диагноза.Интересно, что некоторые компании уже пытаются выполнить автоматический цифровой анализ образцов костного мозга с использованием цифровых изображений. ²⁷

Обычные счетчики клеток зарекомендовали себя как надежный и надежный диагностический инструмент при обнаружении гематологической патологии. Системы цифровой обработки изображений, несомненно, сделают то же самое в ближайшие годы.

ССЫЛКИ

1. Бейн BJ. Диагностика по мазку крови. N Engl J Med .2005; 353 (5): 498-507.
2. Румке CL. Неточность дифференциального подсчета лейкоцитов на основе соотношения. Клетки крови . 1985; 11 (2): 311-314, 315.
3. Bentley SA. Автоматический дифференциальный подсчет лейкоцитов: критическая оценка. Baillieres Clin Haematol . 1990; 3 (4): 851-869.
4. Ceelie H, Dinkelaar RB, van Gelder W. Исследование пленок периферической крови с использованием автоматизированной микроскопии; оценка Diffmaster Octavia и Cellavision DM96. Дж. Клин Патол .2007; 60 (1): 72-79.
5. Tabe Y, Yamamoto T., Maenou I, et al. Оценка производительности цифрового анализатора изображений клеток DI-60, интегрированного в полностью автоматизированную систему гематологического анализатора Sysmex XN. Clin Chem Lab Med . 2015; 53 (2): 281-289.
6. Yu H, Ok CY, Hesse A, et al. Оценка автоматизированной системы цифровой визуализации Nextslide Digital Review Network для исследования мазков периферической крови. Arch Pathol Lab Med . 2012; 136 (6): 660-667.
7. Medica Corporation.Система визуализации гематологии. http://www.medicacorp.com/products/matology-imaging-analyzers.
8. Хиггинс С. Приложения и проблемы цифровой патологии и визуализации целого слайда. Биотех Гистохим . 2015; 90 (5): 341-347.
9. Briggs C, Longair I, Slavik M, et al. Может ли автоматический анализ мазка крови заменить ручной дифференциал? Оценка автоматизированной системы анализа изображений CellaVision DM96. Int J Lab Hematol . 2009; 31 (1): 48-60.
10. Kratz A, Bengtsson HI, Casey JE, et al.Оценка производительности системы CellaVision DM96: дифференциация лейкоцитов с помощью автоматического анализа цифровых изображений, поддерживаемого искусственной нейронной сетью. Ам Дж. Клин Патол . 2005; 124 (5): 770-781.
11. Stouten K, Riedl JA, Levin MD, van Gelder W. Исследование мазков периферической крови: оценка производительности системы цифрового микроскопа с использованием крупномасштабной базы данных лейкоцитов. Int J Lab Hematol . 2015; 37 (5): e137-40.
12. Riedl JA, Stouten K, Ceelie H, Boonstra J, Levin MD, van Gelder W.Межлабораторная воспроизводимость морфологии крови с помощью цифрового микроскопа. Дж. Лаборатория Автомат . 2015; 20 (6): 670-675.
13. Alferez S, Merino A, Mujica LE, Ruiz M, Bigorra L, Rodellar J. Автоматическая классификация атипичных лимфоидных B-клеток с использованием цифровой обработки изображений крови. Int J Lab Hematol . 2014; 36 (4): 472-480.
14. Гао Й, Мансур А., Вуд Б., Нельсон Х., Хига Д., Науглер С. Оценка количества тромбоцитов с помощью системы CellaVision DM96. Дж. Патол Информ .2013; 4: 16-3539.114207.
15. Hervent AS, Godefroid M, Cauwelier B, Billiet J, Emmerechts J. Оценка анализа шистоцитов с помощью нового автоматизированного приложения для цифровой морфологии клеток. Int J Lab Hematol . 2015; 37 (5): 588-596.
16. Эгеле А., ван Гелдер В., Ридл Дж. Автоматическое обнаружение и классификация шистоцитов с помощью нового модуля эритроцитов с использованием цифровых изображений / микроскопии. Дж Гематол . 2015; 4 (2): 184-186.
17. Эгеле А., ван Гельдер В., Ридл Дж.Автоматическое обнаружение и классификация каплевидных клеток с помощью нового модуля RBC с использованием цифровых изображений / микроскопии. Int J Lab Hematol . 2015; 37 (6): e153-6.
18. Racsa LD, Gander RM, Southern PM, et al. Обнаружение внутриклеточных паразитов с помощью анализатора CellaVision DM96 во время рутинного скрининга мазков периферической крови. Дж. Клин Микробиол . 2015; 53 (1): 167-171.
19. Revol B, Thiebaut-Bertrand A, Carre M, Bulabois CE, Mossuz P, Mondet J. Количественная оценка тель-образных включений Howell-Jolly в токсичности ганцикловира с использованием анализатора CellaVision DM96. Br J Haematol . 2016; 174 (4): 647-639.
20. Riedl JA, Dinkelaar RB, van Gelder W. Автоматический морфологический анализ клеток в жидкостях организма с помощью системы цифровой микроскопии DM96. Дж. Клин Патол . 2010; 63 (6): 538-543.
21. Hutchinson CV, Brereton ML, Burthem J. Цифровая визуализация гематологической морфологии. Clin Lab Haematol . 2005; 27 (6): 357-362.
22. Burthem J, Brereton M, Ardern J, et al. Использование цифровых «виртуальных слайдов» при оценке качества гематологической морфологии: результаты пилотного упражнения с участием участников UK NEQAS (H). Br J Haematol . 2005; 130 (2): 293-296.
23. Профессиональное программное обеспечение Cellavision. http://www.cellavision-proficiency.com/.
24. Встреча пользователей Siemens Hemalink, 2014 г. Доступно по адресу: http://www.healthcare.siemens.nl/siemens_hwem-hwem_ssxa_websites-context-root/wcm/idc/groups/public/@nl/documents/download/mda0/njg4/~ edisp / 01_hemalink_new_features-01847846.pdf.
25. Джордж JN, Нестер CM. Синдромы тромботической микроангиопатии. N Engl J Med . 2014; 371 (7): 654-666.
26. Kim HN, Hur M, Kim H, Kim SW, Moon HW, Yun YM. Производительность автоматизированного цифрового анализатора изображений клеток Sysmex DI-60. Clin Chem Lab Med . 2017 56 (1): 94-102.
27. West Medica Austria. Vision Hema: автоматическая идентификация и предварительная классификация клеток крови и клеток костного мозга. http://hema.wm-vision.com.
28. Huisjes R, van Solinge WW, Levin MD, van Wijk R, Riedl JA. Цифровая микроскопия как скрининговый инструмент для диагностики наследственной гемолитической анемии. Int J Lab Hematol . 2017; 1 ноября

Юрген Ридл, доктор философии , клинический химик и заведующий отделением диагностической гематологии лабораторий больницы Альберта Швейцера, входящей в лабораторию результатов в Дордрехте, Нидерланды. Он считается международным экспертом в области цифровых изображений и цифровой морфологии.

Морфологический анализ | Новый дизайн продукта

Общая морфология была разработана Фрицем Цвикки, болгарским астрофизиком из Швейцарии, работающим в Калифорнийском технологическом институте.Среди прочего, Цвикки применил морфологический анализ (МА) к астрономическим исследованиям и разработке реактивных и ракетных двигательных систем.

Чтобы применить морфологический анализ к дизайну продукта, мы просто определяем критические функции на нашей структурной диаграмме функций, а затем определяем множество различных решений для каждой функции. Результаты этого исследования обобщены и представлены в морфологической таблице. Морфологическая диаграмма содержит критические подфункции, перечисленные в первой строке, а затем каждый столбец содержит различные решения для каждой критической функции.

Например, на рисунке ниже показан FSD для пневматического гвоздя.

Рисунок 1. Завершенная структурная схема функции для гвоздезабивателя.

Критические функции — это те функции на диаграмме структуры функций, которые трудно выполнить и / или которые имеют много входов и выходов. Из ФСД для гвоздя. Мы могли бы выбрать функции «изолировать почту», «запустить инструмент» и «применить кинетическую энергию» в качестве критических функций. Для умеренно сложной конструкции продукта обычно выделяют от четырех до шести критических подфункций.Обратите внимание, что функция «принимать энергию» не была выбрана в качестве критической функции, потому что после выбора источника энергии существует очень мало приемлемых способов выполнения функции «принимать энергию». Например, если в доме используется электричество, то мы будут вынуждены использовать стандартную электрическую вилку для приема энергии. Если бы гвоздезабиватель приводился в действие сжатым воздухом, нам пришлось бы использовать стандартный ниппель для приема сжатого воздуха.

Показывает начало морфологической матрицы для проекта гвоздя.Следующим шагом будет заполнение столбцов альтернативными методами для выполнения каждой критической функции.

Морфологическая матрица гвоздя.

Заполненная морфологическая матрица продукта для упражнений по подготовке лежачих пациентов к использованию ходунков показана ниже.

Морфологическая матрица продукта упражнений

Чтобы использовать морфологическую матрицу для генерации концепций, пользователю просто необходимо выбрать одно решение из каждого столбца, а затем попытаться интегрировать решения в полную концепцию.Подробную информацию см. На рисунке ниже.

Создание концептов из морфологической матрицы.

Чтобы заполнить морфологическую матрицу, вам необходимо генерировать идеи. Следующие разделы научат вас техникам как индивидуального, так и группового мышления.

Крупномасштабные реконструкции и независимая, объективная кластеризация на основе морфологических показателей для классификации нейронов в выборочных популяциях

Ранее мы показали, что крупномасштабные реконструкции нейронов в выборочной популяции возможны после инъекции модифицированного вируса бешенства в dLGN ⁵ .Недавно ту же ткань использовали для реконструкции 160 нейронов в зрительном секторе TRN (Bragg et al. , в обзоре; , рис. 2A-B, ), следуя подробным методическим шагам, описанным выше. В исследовании TRN три уникальных кластера нейронов TRN были идентифицированы на основе независимого кластерного анализа 10 морфологических показателей: площадь тела клетки, округлость тела клетки, медиально-латеральное положение относительно центра TRN, дорсально-вентральное положение внутри TRN. , число дендритных деревьев, среднее расстояние между дендритами до узлов, средняя длина дендритов 3 ^{-го порядка} и более высоких порядков, средний угол дендритов 1-го порядка ^{-го порядка} , средний фазовый угол общей дендритной ветвления и угловое отклонение общей дендритной ветви. арборизация.TRN нейроны были одинаково распределены по этим трем кластерам (, рис. 2C, ). Отдельные статистические сравнения всех 10 морфологических показателей нейронов в трех кластерах дали статистически значимые различия между кластерами для всех морфологических показателей, включенных в исходный кластерный анализ, кроме двух. Таким образом, на основе дендрограммы иерархического дерева, созданной в результате кластерного анализа (, рис. 2С, ), и отдельных статистических сравнений морфологических показателей по кластерам, нейроны TRN классифицируются на три уникальные группы.

В этом исследовании мы специально хотели применить статистические методы для отдельной оценки кластеров, определенных с помощью кластерного анализа. Набор данных TRN из предыдущего исследования был оценен, чтобы определить, были ли три наблюдаемых кластера оптимальными. Отдельные дополнительные кластерные анализы, а именно кластеризация PCA и GMM, были выполнены для проверки предшествующих методов кластеризации (, рис. 1, ). Три ключевых результата по отдельности подтверждают предыдущий кластерный анализ. Во-первых, когда исходный метод кластерного анализа был оценен с использованием функции evalclusters, определяющей функцию связи для создания кластеров, оптимальное количество кластеров было 3, что соответствует исходному выводу, основанному на дендрограмме иерархического дерева ( Рисунок 2C ) .Во-вторых, PCA был выполнен на исходной матрице данных из 10 морфологических показателей для 160 нейронов TRN в качестве альтернативного средства группировки нейронов на основе вкладов морфологических показателей. Были сгенерированы три GMM, предполагая, что нейроны TRN были сгруппированы в 1, 2 или 3 уникальных кластера. Отрицательное логарифмическое правдоподобие (NLL) и информационный критерий Акаике (AIC) дали самые низкие и, следовательно, наиболее информативные значения, и оба значения были оптимальными, когда GMM использовал 3 кластера для описания морфологических данных TRN (, рисунок 3, ).В-третьих, кластеризация на основе GMM оценивалась отдельно с использованием функции evalclusters, и оптимальное количество кластеров составляло 3. Таким образом, наблюдения за дендрограммой иерархического дерева, статистические сравнения морфологических показателей по нейронам, разделенным на три кластера, PCA и GMM- кластеризация на основе и отдельные оценки каждого метода кластеризации (сцепления и GMM) дали тот же результат, что нейроны TRN оптимально разделены на 3 кластера на основе 10 используемых морфологических показателей.

Рисунок 1: Формат данных. Пример матрицы данных с n строками, соответствующими количеству нейронов, и m = 5 столбцами, соответствующими общему количеству независимых переменных, которые необходимо включить в кластерный анализ (не включать заголовки в матрицу данных).

Рисунок 2: Независимая кластеризация 160 нейронов TRN. A. Слева, фотография единственного коронарного среза через dLGN одного животного, окрашенного на цитохромоксидазную активность для визуализации слоев dLGN и против GFP для визуализации инъекции вируса.Стрелка указывает области плотных ретроградно меченых нейронов TRN. Ориентация сечения соответствует дорсально-вентральному / медиально-латеральному (DV / ML) компасу ниже, а масштабная линейка представляет 500 мкм для всех панелей в A . Второй слева, контурные контуры dLGN (красный) и TRN (бордовый) для всех секций, содержащих вирусную инъекцию (черные контуры). Желтые звезды обозначают центры мест инъекции. Ориентация и масштабные линейки как в A . Третий слева, трехмерные изображения контуров и места инъекции, ориентации и масштабных полос, как в A .Справа — карты местоположений реконструированных нейронов TRN, обозначенные цветом в соответствии с назначением кластера ( C ) в пределах единого агрегированного контура TRN (темно-бордовый). Ориентация и масштабные линейки как в A . Б . Слева: агрегированные контуры TRN (черный) и dLGN (серый) с 5 реконструированными нейронами TRN, окрашенными от теплого до холодного в соответствии с их медиально-латеральным положением в пределах TRN. Ориентация согласно компасу DV / ML в A , масштабная линейка соответствует 500 мкм. Справа, фотографии тех же 5 нейронов TRN с подобранными по цвету шкалами, представляющими 100 мкм. С . Дендрограмма иерархического дерева после кластерного анализа, иллюстрирующая расстояния сцепления между 160 реконструированными TRN нейронами на основе 10 независимых морфологических показателей. Три кластера показаны синим, зеленым и красным. Все части этого рисунка адаптированы из рисунков, включенных в Bragg et al. (в обзоре). Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Оценка кластера. График двух различных значений критерия, отрицательного логарифма правдоподобия (NLL, красный) и информационного критерия Акаике (AIC, синий), созданных из трех GMM, предполагающих 1, 2 или 3 кластера.GMM с 3 кластерами обеспечивают самые низкие значения критериев.

Файл дополнительного кода: Пример кода, написанный на языке, совместимом с Matlab, для выполнения кластерного анализа на примере матрицы данных с последующей оценкой кластера с использованием подходов PCA и GMM. Щелкните здесь, чтобы загрузить этот файл.

Требуется подписка. Пожалуйста, порекомендуйте JoVE своему библиотекарю.

Журналы CSC | Быстрорастущая сеть для публикаций открытого доступа

.